PI3K-Akt-GSK-3β和線粒體ATP敏感鉀通道介導(dǎo)原花青素對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、隨著靜脈溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈脈介入術(shù)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)在臨床的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的醫(yī)生和科研工作者意識(shí)到心肌缺血再灌注損傷的重要性。盡早、持續(xù)、充分的開(kāi)通梗死相關(guān)血管，恢復(fù)缺血心肌的血液灌注，搶救瀕臨死亡的心肌是缺血性心臟病、急性心肌梗死最重要的治療原則。但是，再灌注治療是把“雙刃劍”，在恢復(fù)冠脈血流的同時(shí)加重組織損傷，出現(xiàn)心功能不全、心律失常、心肌梗死面積擴(kuò)大等嚴(yán)重現(xiàn)象。因此找到有效的減輕缺血再灌注損傷的方法是非常重要的課題。許多研究

2、發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)、藥物預(yù)適應(yīng)是抗心肌缺血再灌注損傷有效方法，可以誘導(dǎo)釋放內(nèi)源性活性物質(zhì)，并通過(guò)機(jī)體內(nèi)源性的機(jī)制如蛋白激酶C、磷脂酰肌醇-3-激酶、線粒體ATP敏感鉀通道而發(fā)揮保護(hù)作用。
　　 心肌的缺血再灌注損傷是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程，目前公認(rèn)的主要致病機(jī)制包括:氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞能量喪失，中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)激活等。同時(shí)缺血再灌注損傷涉及到機(jī)體內(nèi)很多調(diào)控機(jī)制和信號(hào)通路的激活和失活。活性氧在缺血再灌注過(guò)

3、程中大量產(chǎn)生，具有很強(qiáng)的化學(xué)活性，活躍的電子很容易與細(xì)胞的組成物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)，抑制蛋白質(zhì)的功能并且破壞核酸及染色體，從而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞凋亡是連續(xù)性程序化細(xì)胞死亡，在整個(gè)過(guò)程中涉及到一系列特殊基因和蛋白的表達(dá)，細(xì)胞發(fā)生特征性的形態(tài)學(xué)和生化變化。凋亡在心肌缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。抑制心肌細(xì)胞凋亡可明顯縮小心肌梗死的面積。磷脂酰肌醇-3激酶和其下游的蛋白激酶B(Akt)通路是細(xì)胞內(nèi)重要

4、的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的凋亡、存活，以及增殖等活動(dòng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。大量的研究表明，藥物預(yù)處理可以激活心肌細(xì)胞內(nèi)的P13K/Akt信號(hào)通路，在心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)中起決定性的作用。線粒體ATP敏感鉀通道也參與缺血再灌注損傷，線粒體ATP敏感鉀通道開(kāi)放劑可以發(fā)揮缺血預(yù)處理保護(hù)作用，而該通道的抑制劑可以阻斷缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。線粒體ATP敏感鉀通道存在于線粒體內(nèi)膜，KATP通道開(kāi)放調(diào)節(jié)鉀離子活動(dòng)，維持線粒體容積，減少缺血期細(xì)

5、胞鈣超載和再灌注期活性氧的大量生成，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。
　　 原花青素是從葡萄籽中提取的一類(lèi)多酚化合物，具有極強(qiáng)的抗氧化活性，前期的研究發(fā)現(xiàn)原花青素有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎等作用，但原花青素對(duì)心肌缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用以及內(nèi)在的機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠缺血再灌注損傷模型和離體乳鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，從器官、細(xì)胞、分子水平研究原花青素對(duì)心肌缺血再灌注損傷的作用和作用機(jī)理。
　　 第一部分

6、原花青素減輕心肌缺血再灌注損傷的研究
　　 目的:通過(guò)建立在體大鼠急性心肌缺血再灌注模型，觀察原花青素對(duì)心臟收縮舒張功能、心肌酶CK-MB和CTnⅠ水平、心肌梗死面積的影響。同時(shí)利用PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制劑LY294002，驗(yàn)證PI3K/Akt信號(hào)通路是否在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用。
　　 方法:取雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)、缺血再灌注組(I/R組)、原花青素組(PC組)、LY294004阻斷組（

7、LY294002組）共四組。PC組和LY294002組大鼠進(jìn)行PC溶液灌胃，每天250mg/kg，共4周。SO組和I/R組的大鼠每天用相同體積的生理鹽水灌胃，共4周。末次給藥24h內(nèi)，構(gòu)建大鼠在體心肌缺血再灌注模型。SO組只開(kāi)胸置縫線而不結(jié)扎，I/R組、PC組和LY294002組動(dòng)物均開(kāi)胸手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30分鐘，松開(kāi)結(jié)扎線120min，建立急性心肌缺血再灌注損傷模型。LY294004組于缺血前10min頸靜脈注射LY29400

8、2。分別于左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎前(To)、心肌缺血30 min(T1)、再灌注30min(T2)、再灌注1h(T3)、再灌注2h(T4)時(shí)測(cè)定左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓(LVDEP)、左室內(nèi)壓上升/下降的最大速率(±dp/dtmax)。再灌注2h后測(cè)血清肌酸磷酸激酶(CK-MB)、肌鈣蛋白Ⅰ的水平，用伊文思藍(lán)和氯化三苯四唑啉染色法測(cè)定心肌梗死面積。
　　 結(jié)果:1、各組大鼠心臟收縮舒張功能比較:各組大鼠缺血前LVSP

9、、LVEDP、±dp/dtmax的基礎(chǔ)值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SO組各指標(biāo)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除SO組外，各組的LVSP、±dp/dtmax均逐漸下降，再灌注2h與缺血前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各組的LVEDP均逐漸升高，再灌注2h與缺血前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與SO組比較，I/R組LVSP、±dp/dtmax降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);LVEDP升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與I/R組

10、比較，PC組LVSP、±dp/dtmax升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);LVEDP減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與PC組比較，LY294002組LVSP、±dp/dtmax降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); LVEDP升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LY294002組與I/R組的指標(biāo)比較無(wú)差異。
　　 2、各組血清CK-MB和CTn1的比較:與SO組比較，I/R組CK-MB和CTn1升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

11、1);與I/R組比較，PC組CK-MB和cTn1降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與PC組比較，LY294002組CK-MB和cTn1升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);LY294002組與I/R組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.各組大鼠心肌梗死、缺血范圍的比較:與SO組(0)比較，I/R組(38.6±2.7％)心肌梗死面積顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與I/R組比較，PC組(15.2±2.2％)心肌梗死面積降低，有統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與PC組比較，LY294002組(30.3±2.4％)心肌梗死面積升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。LY294002組與I/R組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除SO組外，各組心肌缺血面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:1、心肌缺血再灌注損傷表現(xiàn)為心臟收縮舒張功能下降、心肌組織嚴(yán)重壞死。2、原花青素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可以改善心臟收縮舒張功能，減少心肌酶水平，減少心肌梗死面積。3、阻斷PI3K/Ak

13、t信號(hào)通路后，原花青素的心臟保護(hù)作用消失，原花青素的心肌缺血再灌注保護(hù)作用與PI3K/Akt信號(hào)通路激活有關(guān)。
　　 第二部分 PI3K/Akt/GSK-3β和線粒體ATP敏感鉀通道在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用機(jī)制
　　 目的:以原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(Anoxia/Reoxygenation，A/R)損傷模型，在細(xì)胞水平模擬心肌缺血再灌注損傷，觀察原花青素預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞生存率、

14、活性氧水平、凋亡的影響，探討原花青素對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用機(jī)制;同時(shí)應(yīng)用PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑LY294002和線粒體ATP敏感鉀通道抑制劑5-羥葵酸，從分子水平闡明PI3K/Akt/GSK-3β通路和線粒體ATP敏感鉀通道與原花青素心肌保護(hù)作用的關(guān)系。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)用SD新生大鼠(1-3d)，無(wú)菌取出乳鼠心臟，經(jīng)分離附著組織，胰蛋白酶消化，差速貼壁法純化制成心肌細(xì)胞，以1×106/cm2的細(xì)胞密度接種于培

15、養(yǎng)皿。在培養(yǎng)48h后隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組(Control組);缺氧/復(fù)氧組(A/R組):細(xì)胞行缺血3h復(fù)氧3h;原花青素預(yù)處理+A/R組(PC組):細(xì)胞缺氧前加入100ug/ml原花青素預(yù)作用30min，再行缺氧復(fù)氧;LY294002+PC+A/R組(LY294002組):培養(yǎng)基中加入濃度為15umol/l的LY294002，30min后加原花青素，30min后再行缺氧復(fù)氧;;5-HD+PC+A/R組（5-HD組）:培養(yǎng)基中加入濃度

16、為100umol/L的5-HD，30min后加原花青素，30min后再行缺氧復(fù)氧。檢測(cè)以下指標(biāo):細(xì)胞存活率(MTT法);細(xì)胞核Hoeehst33258染色;心肌細(xì)胞的ROS水平;Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率;Western blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Akt、磷酸化Akt、GSK—3β、磷酸化GSK—3β的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:1、心肌細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果
　　 倒置顯微鏡下觀察:細(xì)胞呈

17、放射狀，漩渦狀，細(xì)胞核呈橢圓形，多數(shù)居中，細(xì)胞呈片狀有節(jié)律搏動(dòng)。
　　 2、各處理組心肌細(xì)胞存活率
　　 A/R組(41.51±3.86％)心肌細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞存活率明顯降低，與Control組(92.36±3.12％)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);PC組(75.74±4.69％)與A/R組相比細(xì)胞存活率升高，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01); LY294002組(47.52±4.71％)與PC組相比細(xì)胞存

18、活率降低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，與A/R組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;5-HD組(48.13±4.68％)與PC組相比細(xì)胞存活率降低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，與A/R組相比，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;LY294002組、5-HD組相比兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核的改變:
　　 control組細(xì)胞核為圓形且熒光強(qiáng)度較弱，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞核固縮、核破裂，可見(jiàn)

19、強(qiáng)的藍(lán)色熒光，且不均勻，強(qiáng)藍(lán)染的細(xì)胞明顯增多。PC組強(qiáng)藍(lán)染的細(xì)胞較缺氧復(fù)氧組減少。LY294002組、5-HD組細(xì)胞的改變同缺氧復(fù)氧組相似。
　　 4、各處理組心肌細(xì)胞的ROS水平
　　 A/R組（熒光強(qiáng)度為211.6±38.4）與Control組(27.0±5.6)相比細(xì)胞的ROS增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); PC組(80.1±10.3)與A/R組相比細(xì)胞的ROS水平減少，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.

20、01);LY294002組(167.2±18.3)與PC組相比細(xì)胞的ROS水平增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，與A/R組相比，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;5-HD組(178.3±22.8)與PC組相比細(xì)胞的ROS水平增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，與A/R組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;LY294002組、5-HD組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5、Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　 A/R組(25.3±2.64％)與C

21、ontrol組(3.1±0.65％)相比細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); PC組(10.2±1.59％)與A/R組相比細(xì)胞凋亡減少，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01); LY294002組(19.6+1.79％)與PC組相比細(xì)胞凋亡增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，與A/R組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;5-HD組(18.1±2.03％)與PC組相比細(xì)胞凋亡增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，與A/

22、R組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;LY294002組、5-HD組相比細(xì)胞凋亡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡水平
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行Annexin V/PI雙染色對(duì)細(xì)胞的凋亡水平進(jìn)行分析測(cè)定。Annexin V+/PI-為早期凋亡細(xì)胞，位于十字象限的右下方。 A/R組(30.71％±3.82％)與Control組(8.36±1.25％)相比凋亡增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);PC組(13.11

23、±1.36％)與A/R組相比細(xì)胞凋亡減少，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);LY294002組(26.12±2.07％)與PC組相比凋亡明顯增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，與A/R組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;5-HD組(27.47±2.15％)與PC組相比凋亡增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，與A/R組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;LY294002組、5-HD組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 7、Western blotting

24、分析Caspase-3、t-Akt、p-Akt、t-GSK-3β、p-GSK-3β的表達(dá)水平。
　　 心肌細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平:Caspase-3蛋白表達(dá)水平可以反映心肌細(xì)胞凋亡的程度，Caspase-3蛋白表達(dá)高，則凋亡的心肌細(xì)胞多，反之，Caspase-3蛋白表達(dá)低，則凋亡的心肌細(xì)胞少。A/R組與Control組相比，Caspase-3蛋白表達(dá)增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); PC組與A/R組相比C

25、aspase-3蛋白表達(dá)減少，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01); LY294002組與PC組相比Caspase-3蛋白增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，與A/R組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;5-HD組與PC組相比Caspase-3蛋白增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，與A/R組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;LY294002組、5-HD組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 心肌細(xì)胞t-Akt、p-Akt蛋白水平:A/R組與Control組

26、相比，p-Akt蛋白表達(dá)略增加，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PC組與A/R組相比p-Akt蛋白表達(dá)明顯增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);LY294002組與PC組相比p-Akt蛋白表達(dá)明顯減低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);5-HD組與LY294002組相比p-Akt蛋白表達(dá)升高，有顯著性差異(p＜0.01)，與PC組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而t-Akt蛋白表達(dá)水平在各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明是p-Akt發(fā)揮作用。
　　 心肌

27、細(xì)胞t-GSK-3β、p-GSK-3β的表達(dá)水平:A/R組與Control組相比，p-GSK-3β蛋白表達(dá)略增加，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;PC組與A/R組相比p-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01); LY294002組與PC組相比p-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯減低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);5-HD組與LY294002組相比p-GSK-3β蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，與原花青素組相

28、比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而t-GSK-3β蛋白表達(dá)水平存各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明是p-GSK-3β發(fā)揮作用。
　　 結(jié)論:1、從細(xì)胞水平證明了原花青素預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用，表現(xiàn)為提高細(xì)胞生存率、減少活性氧水平、減少細(xì)胞凋亡。
　　 2、加入PI3K阻斷劑LY294002后原花青素的保護(hù)作用消失，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)P13K/Ak/GSK-3β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與原花青素預(yù)處理心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用。