LRRFIP1基因干擾預(yù)防骨科深靜脈血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　深靜脈血栓形成是骨科臨床常見并發(fā)癥之一，好發(fā)于下肢骨折患者，如血栓脫落可引起致命性肺栓塞，晚期常遺留靜脈炎綜合征，嚴(yán)重影響患者的康復(fù)及生命安全。新近有研究表明富亮氨酸重復(fù)序列相互作用蛋白1(LRRFIP1)可能與血栓的形成有重要聯(lián)系。LRRFIP1基因及其編碼的蛋白質(zhì)，通過與血小板細(xì)胞膜上表達(dá)的相關(guān)蛋白相互作用，血小板細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)進(jìn)而發(fā)生改變，影響血小板的凝血功能并導(dǎo)致血栓的形成。因此我們擬通過RNA干擾技術(shù)靶向

2、沉默LRRFIP1基因，并建立動物模型，觀察LRRFIP1基因?qū)ι铎o脈血栓形成的影響，探討LRRFIP1基因沉默對預(yù)防骨科深靜脈血栓形成的效果，為最終應(yīng)用于在體基因治療深靜脈血栓提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:
　　1、LRRFIP1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建
　　設(shè)計(jì)并合成LRRFIP1基因靶向的雙鏈DNA:根據(jù)GenBank報(bào)道的小鼠LRRFIP1基因序列，通過將Ambion公司的設(shè)計(jì)軟件與RNA干擾序列的設(shè)計(jì)

3、原則相結(jié)合，設(shè)計(jì)出3對針對LRRFIP1基因shRNA的寡核苷酸序列，分別構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，RT-PCR和westernblot測定沉默效率，使用沉默效率最高的質(zhì)粒構(gòu)建LRRFIP1基因RNAi的慢病毒載體。
　　2、小鼠骨髓細(xì)胞原代分離與培養(yǎng)
　　將1周齡的新生小鼠消毒后處死，分離骨髓細(xì)胞，接種于無菌培養(yǎng)瓶，置37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取生長良好的第三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3、小鼠骨髓細(xì)胞慢

4、病毒感染
　　在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，將3～5×104個(gè)目的細(xì)胞接種至每個(gè)孔內(nèi)，50％左右細(xì)胞的貼壁率應(yīng)在鋪板時(shí)達(dá)到，每孔培養(yǎng)基體積為100μl;70％左右的細(xì)胞貼壁率應(yīng)在進(jìn)行病毒感染時(shí)達(dá)到。感染96小時(shí)后，在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光，估計(jì)慢病毒感染目的細(xì)胞的效率。
　　4、動物分組與給藥
　　將健康成年雄性ICR小鼠(20±2g)隨機(jī)分為:1）正常對照組(control);2)假手術(shù)組(sham):不給藥;3）低分

5、子肝素(LMWH)治療組(LMWH):術(shù)前通過尾靜脈注射LMWH一次(2000U·kg-1)，術(shù)后每日注射一次LMWH(2000U·kg-1·d-1);4）模型組(model):術(shù)前、術(shù)后每日注射等體積生理鹽水;5）LRRFIP1shRNA治療組(shRNA):術(shù)前注射LRRFIP1shRNA慢病毒感染的小鼠BMCs(1×107cells/mouse);6)陰性shRNA治療組(NegativeshRNA):術(shù)前注射LRRFIP1陰性對

6、照shRNA慢病毒感染的小鼠BMCs(1×107cells/mouse);采用下腔靜脈結(jié)扎法制作小鼠深靜脈模型。
　　分別于術(shù)后第1、3、7天每組處死6只小鼠。稱量血栓重量;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清p選擇素及D二聚體水平，Westernblot檢測血栓中LRRFIP1蛋白的表達(dá)。
　　5、統(tǒng)計(jì)分析
　　計(jì)量資料表示為means±S.D。采用SPSS17.0forWindows進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用

7、單因素方差分析，多組間兩兩比較采用FisherLSD分析。以p＜0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建了攜LRRFIP1shRNA的慢病毒載體，LRRFIP1shRNA轉(zhuǎn)染后LRRFIP1基因及蛋白表達(dá)均顯著降低;
　　2.LRRFIP1shRNA顯著抑制血栓中LRRFIP1蛋白表達(dá)。在模型組中，在術(shù)后第1、3、7天血栓中LRRFIP1蛋白的表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。在所觀察的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，使用L

8、RRFIP1shRNA處理可以進(jìn)一步抑制LRRFIP1在血栓中的表達(dá)，提示LRRFIP1shRNA慢病毒在體內(nèi)可以有效抑制LRRFIP1的表達(dá)。但低分子肝素和陰性shRNA對LRRFIP1表達(dá)無影響。
　　3.LRRFIP1shRNA顯著抑制小鼠下肢靜脈血栓形成。LRRFIP1shRNA抑制體內(nèi)血栓形成明顯的。在術(shù)后第7天，模型組小鼠血栓重量為8.63±0.40mg，在LRRFIP1shRNA治療組，血栓重量降低到2.15±0.5

9、7mg(P＜0.01)。血栓形成抑制率為75.10％。而在低分子肝素治療組和陰性shRNA治療組，血栓重量分別為2.20±0.33mg和6.47±0.66mg，血栓形成抑制率分別為74.50％and25.02％。
　　4.LRRFIP1shRNA能夠降低小鼠血清p-選擇素和d-二聚體水平。與正常對照組和假手術(shù)組相比，模型組血漿P-選擇素水平明顯增加(P＜0.01)。LRRFIP1shRNA治療顯著降低血漿P-選擇素水平(P＜0.0

10、1)。血漿D-二聚體水平在模型組也明顯升高(P＜0.01)，而LRRFIP1shRNA治療可顯著地抑制D-二聚體水平的上調(diào)(P＜0.01)。然而，低分子肝素和陰性shRNA對血漿P-選擇素、D-二聚體水平的影響不大。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了LRRFIP1shRNA表達(dá)質(zhì)粒及慢病毒載體;
　　2.LRRFIP1shRNA在體內(nèi)、外均能夠抑制LRRFIP1mRNA和蛋白表達(dá);
　　3.LRRFIP1基因干擾能