香加皮有效成份抑制大鼠食管癌形成及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、食管癌是我國(guó)最常見的消化道惡性腫瘤之一，惡性程度高，發(fā)病原因不明，造成預(yù)防困難；因缺乏十分有效的診治方法，發(fā)病率、死亡率居高不下，總5年生存率不超過10％。因此，通過預(yù)防降低食管癌發(fā)生率十分重要。流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，早期癌或癌前病變的發(fā)現(xiàn)、診斷和治療是目前降低食管癌發(fā)病率和死亡率的主要措施，發(fā)現(xiàn)癌前病變逆轉(zhuǎn)分化藥物是降低食管癌死亡率的理想手段。中醫(yī)藥在腫瘤防治中的作用越來越受到人們的重視。已有大量研究證實(shí)，部分中藥對(duì)食管癌的發(fā)生有一定

2、防治作用，香加皮三萜類化合物（TCCP）是本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的既有抗腫瘤作用又有免疫調(diào)節(jié)活性的抗腫瘤活性成分，對(duì)胃癌、肝癌、乳腺癌都有較好的增殖抑制作用，對(duì)食管癌細(xì)胞的體外抑制效果也很明顯，但是在體內(nèi)抗腫瘤效果及作用機(jī)理尚不清楚。
　　 本課題首先用甲基芐基亞硝胺（NMBA）誘導(dǎo)建立了大鼠食管癌前病變模型，檢測(cè)了在食管癌形成過程中與細(xì)胞異常增殖相關(guān)的分子、蛋白及其基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化和相互關(guān)系，以及外周血免疫相關(guān)分子的變化，分析了香加皮

3、三萜類化合物對(duì)NMBA誘發(fā)食管癌發(fā)生中上述分子表達(dá)變化的影響，為香加皮三萜類化合物的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 第一部分香加皮三萜類化合物對(duì)荷食管癌細(xì)胞裸鼠的抑瘤作用研究
　　 目的：觀察TCCP對(duì)荷食管鱗癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用，探討其體內(nèi)對(duì)荷食管癌移植瘤的抑制作用。
　　 方法：將穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因（Luc）的人食管癌細(xì)胞株Eca109-luc細(xì)胞接種于裸鼠左側(cè)肋腹部皮下，建立Eca109-luc細(xì)胞荷

4、瘤裸鼠模型，待腫瘤生長(zhǎng)至直徑約5-7mm時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為生理鹽水處理組和TCCP（20mg/kg）治療組，每組7只，隔日于瘤周注射生理鹽水或藥物一次，療程4周。應(yīng)用美國(guó)精諾真活體成像系統(tǒng)（Xenogen IVIS Imaging System）觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，采用流式細(xì)胞儀分析腫瘤組織細(xì)胞的凋亡率；用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)腫瘤組織凋亡相關(guān)基因Fas和Survivin的表達(dá)變化。
　　 結(jié)論：TCCP在體

5、內(nèi)能明顯抑制食管癌細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能是調(diào)節(jié)Fas/FasL分子表達(dá)、下調(diào)腫瘤組織凋亡抑制基因Survivin的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)。
　　 第二部分香加皮三萜類化合物對(duì)大鼠食管癌前病變的阻斷作用及其機(jī)制研究
　　 實(shí)驗(yàn)一大鼠食管癌前病變模型的建立及香加皮三萜類化合物對(duì)其阻斷作用
　　 目的：研究NMBA誘導(dǎo)F344大鼠食管上皮癌前病變形成過程中組織病理學(xué)改變、細(xì)胞周期調(diào)控因子和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的

6、改變及TCCP對(duì)以上分子表達(dá)的影響。
　　 方法：雄性F344大鼠165只，隨機(jī)分為5組：1正常對(duì)照組（對(duì)照1組，n=15），常規(guī)飼養(yǎng)；2大豆油對(duì)照組（對(duì)照2組，n=15），每只大鼠注射大豆油1ml/kg，每周3次，共注射5周，常規(guī)飼養(yǎng)；3單純誘癌組（n=45），皮下注射NMBA0.5mg/kg，每周3次，共給藥5周，常規(guī)飼養(yǎng)；4 TCCP高劑量干預(yù)組（干預(yù)1組，n=45），每只大鼠皮下注射NMBA（0.5mg/kg）后，同時(shí)肌

7、注TCCP（20mg/kg），每周3次，共給藥5周，常規(guī)飼養(yǎng)；5 TCCP低劑量干預(yù)組（干預(yù)2組，n=45），每只大鼠皮下注射NMBA（0.5mg/kg）后，同時(shí)肌注TCCP（10mg/kg），每周3次，共給藥5周，常規(guī)飼養(yǎng)。在誘癌開始后9、15和25周時(shí)，各取對(duì)照1、2組大鼠5只，單純誘癌組和干預(yù)1、2組各取15只大鼠，麻醉后解剖大鼠，肉眼觀察食管粘膜大體變化；HE染色后光鏡下觀察食管上皮組織病理學(xué)變化；采用免疫組化方法檢測(cè)各組食管組

8、織PCNA、cyclinD1及CDK4蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)論：甲基芐基亞硝胺（0.5mg/kg）可誘導(dǎo)F344大鼠食管癌前病變的發(fā)生；單純誘癌組大鼠食管上皮出現(xiàn)典型的癌前病變組織病理學(xué)變化，食管上皮組織中增殖相關(guān)蛋白PCNA及周期調(diào)控因子CDK4和cyclinD1的表達(dá)水平明顯升高；香加皮三萜類化合物早期干預(yù)可明顯抑制甲基芐基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠食管癌前病變的發(fā)生與發(fā)展，該作用可能與其抑制大鼠食管組織上皮中PCNA、CDK4和cy

9、clinD1表達(dá)有關(guān)。
　　 實(shí)驗(yàn)二香加皮三萜類化合物對(duì)大鼠食管癌前病變形成過程中Wnt信號(hào)通路的影響
　　 目的：研究TCCP對(duì)NMBA誘導(dǎo)F344大鼠食管癌前病變形成過程中，Wnt信號(hào)通路分子表達(dá)變化，進(jìn)一步探討其抑制食管癌前病變的作用機(jī)理。
　　 方法：分別取各組大鼠食管組織，用RT-PCR法檢測(cè)c-myc mRNA表達(dá)水平；用Western blot法檢測(cè)GSK-3β和β-catenin蛋白表達(dá)水平。

10、r>　　 結(jié)論：TCCP可能通過促進(jìn)Wnt信號(hào)分子GSK-3β的表達(dá)，抑制β-catenin蛋白的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)下游靶基因c-myc的轉(zhuǎn)錄，干擾細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的分化，可能是其抑制食管癌變細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制之一。
　　 第三部分香加皮三萜類化合物對(duì)食管癌前病變大鼠免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討TCCP抑制大鼠食管癌前病變形成過程中免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理。
　　 方法：
　　 1.采用流式細(xì)胞技術(shù)分析

11、TCCP對(duì)NMBA誘癌大鼠外周血中T細(xì)胞亞群CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率的影響，用半定量RT-PCR技術(shù)分析其對(duì)大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中Foxp3 mRNA表達(dá)水平的影響。
　　 2.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析香TCCP對(duì)NMBA誘癌大鼠外周血PBMC中細(xì)胞因子IL-2、IL-10、TGF-βmRNA表達(dá)水平的影響，應(yīng)用ELISA檢測(cè)技術(shù)分析TCCP對(duì)NMBA誘癌大鼠外周血中細(xì)胞因子IL-2、IL-10、TGF-β