腎淋巴循環(huán)障礙對(duì)大鼠腎臟損害的機(jī)制研究及sirt3對(duì)腎臟的作用研究.pdf

1、淋巴循環(huán)(lymph ciruclation)是循環(huán)系統(tǒng)的重要輔助部分，它可將腎組織間隙中多余的液體、淋巴細(xì)胞、電解質(zhì)和蛋白質(zhì)運(yùn)送回血液系統(tǒng)，對(duì)于維持體液穩(wěn)定起著重要作用。關(guān)于淋巴循環(huán)的研究已有300余年的歷史，但是其研究進(jìn)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他系統(tǒng)。我們現(xiàn)在已經(jīng)明確了淋巴管及淋巴結(jié)的分布及走行，對(duì)淋巴的組成及調(diào)節(jié)有了測(cè)定，初步建立了淋巴循環(huán)的體系，但是對(duì)于淋巴管的發(fā)生、形態(tài)、功能及調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠?？梢哉f(shuō)，與循環(huán)系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)相比，淋巴

2、系統(tǒng)并未引起人們足夠的重視。在腎臟移植手術(shù)中，淋巴管往往不予以結(jié)扎。此外，很多臨床疾病及臨床操作如炎癥、腫瘤、創(chuàng)傷及外科手術(shù)等亦可以損傷淋巴循環(huán)。對(duì)于淋巴循環(huán)的有限認(rèn)識(shí)有礙于醫(yī)學(xué)的發(fā)展。目前淋巴循環(huán)的研究已經(jīng)逐漸起步，關(guān)于心、腦、肝及胃腸等器官淋巴循環(huán)障礙的報(bào)導(dǎo)已見(jiàn)報(bào)端，但是關(guān)于腎臟淋巴循環(huán)障礙的研究甚少。
　　 早期研究表明，腎門(mén)淋巴管急性結(jié)扎對(duì)腎功能有顯著影響。此外，胸導(dǎo)管結(jié)扎可以導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)彌漫性硬化。但是我們對(duì)于腎淋巴管的

3、了解依然有限，而且在腎移植手術(shù)中，淋巴管的重要性常被忽略。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)腎淋巴管結(jié)扎后大鼠出現(xiàn)腎功能不全、蛋白尿及腎小管上皮細(xì)胞凋亡，但是其作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。
　　 慢性腎臟衰竭的進(jìn)展主要表現(xiàn)為腎臟細(xì)胞丟失及腎臟細(xì)胞被細(xì)胞外基質(zhì)及成纖維細(xì)胞取代。近年來(lái)，凋亡已被證實(shí)參與腎臟細(xì)胞丟失過(guò)程。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，是機(jī)體的一種正常細(xì)胞的更新和異常細(xì)胞清除，而在病理狀態(tài)下異常的凋亡又與眾多系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。眾

4、所周知，凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，主要有兩條途徑--內(nèi)源性途徑和外源性途徑。內(nèi)源性凋亡途徑又稱(chēng)線粒體/細(xì)胞色素C(cytochrome c，Cytc)途徑，線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，還是細(xì)胞凋亡調(diào)控的中心。當(dāng)線粒體受到細(xì)胞內(nèi)損傷如氧化應(yīng)激時(shí)，內(nèi)源性途徑被激活。Bcl-2家族促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白比例增高，線粒體膜的通透性增加。細(xì)胞色素C釋放入胞漿并激活下游細(xì)胞凋亡途徑，最終激活“執(zhí)行caspase

5、”-caspase3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。外源性凋亡途徑又稱(chēng)為死亡受體通路，是由胞外腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族的死亡配體引發(fā)的。腫瘤壞死因子家族配體如Fas受體(Fas ligand，F(xiàn)asL)結(jié)合到其受體上并激活caspase8，繼而激活下游“執(zhí)行caspase”，比如caspase3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。我們已經(jīng)證實(shí)腎淋巴管結(jié)扎后大鼠出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，那么在這個(gè)過(guò)程中兩條凋亡途徑起著什么樣

6、的作用呢?其凋亡的機(jī)制又如何呢?
　　 為了闡明腎淋巴管結(jié)扎與。腎臟疾病進(jìn)展、腎臟細(xì)胞凋亡的關(guān)系以及哪些基因和蛋白參與其中，我們以腎淋巴循環(huán)障礙的單腎切除大鼠為模型，做了以下研究。
　　 目的:
　　 1.構(gòu)建腎淋巴循環(huán)障礙大鼠模型；
　　 2.觀察腎淋巴循環(huán)障礙對(duì)大鼠的影響；
　　 3.探討腎淋巴循環(huán)障礙所致腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.動(dòng)物模型建立：<

7、br>　　 選取250-300g雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天。54只大鼠隨機(jī)分為三組：KL組(n=18)，KN組(n=18)及sham組(n=18)。動(dòng)物處理如下：KL組大鼠，切除右腎并結(jié)扎左腎腎門(mén)淋巴管及左腎上下極脂肪纖維組織；KN組大鼠，手術(shù)步驟同前，只是不結(jié)扎淋巴管；sham組大鼠，開(kāi)腹后隨即縫合，不結(jié)扎腎臟淋巴管亦不切除腎臟。腎淋巴管結(jié)扎方法簡(jiǎn)介如下：在外科顯微鏡下于腎被膜下及腎實(shí)質(zhì)內(nèi)注射2％E

8、vans藍(lán)，淋巴管顯示清楚后結(jié)扎腎門(mén)淋巴管及腎上下極脂肪纖維組織。各組大鼠分別于術(shù)后第1、7、14天各處死6只。收取腎臟標(biāo)本、24小時(shí)尿液及血標(biāo)本。
　　 2.蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色：
　　 腎臟組織在4％多聚甲醛中固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋后制成4μm厚切片。取石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、HE染色、脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察。
　　 3.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：
　　

9、組織切片制作處理方法如上，使用腎臟細(xì)胞原位凋亡(TUNEL)試劑盒進(jìn)行凋亡檢測(cè)，所有操作均按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每張玻片任選10個(gè)獨(dú)立高倍視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，每100個(gè)細(xì)胞內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)以百分?jǐn)?shù)表示為細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　 4.腎臟氧化應(yīng)激檢測(cè)：
　　 選取新鮮腎臟組織，提取組織蛋白并并用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，采用相應(yīng)ELISA試劑盒檢測(cè)腎臟組織活性氧(ROS)產(chǎn)生水平，測(cè)定450 nm及620 nm處吸光度，以62

10、0 nm處吸光度為參照；丙二醛(MDA)測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，測(cè)定532nm處吸光度后根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)采用黃嘌呤氧化酶法，測(cè)定550hm處吸光度后根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算；所有操作均按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
　　 5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：
　　 腎臟組織置于RNA保護(hù)液中保存，采用Trizol法提取腎臟組織總RNA，ABI7500機(jī)器實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)Bax、Bcl-2、FasL和Gapdh的m

11、RNA表達(dá)。Gapdh用作管家基因。
　　 6.Western blot檢測(cè)：
　　 取腎臟新鮮組織，采用組織總蛋白提取試劑盒提取。腎臟組織總蛋白，Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、FasL蛋白表達(dá)水平；采用胞漿蛋白提取試劑盒提取腎臟組織胞漿蛋白，Western blot檢測(cè)細(xì)胞色素C(cytc)的蛋白表達(dá)水平。
　　 7.caspase8、caspase9及caspase3的活性檢測(cè)：
　　

12、 采用相應(yīng)活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase8、caspase9及caspase3活性。取新鮮組織，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)制作組織裂解液，加入反應(yīng)體系孵育后測(cè)定405nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)的比較采用方差齊性檢驗(yàn)與單因素方差分析，定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，檢驗(yàn)水平α=0.05。
　　 1.腎臟功能變化：
　　

13、結(jié)果:
　　 Sham組的腎功能在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有明顯變化，與之相比，KL組及KN組尿蛋白及血肌酐水平自術(shù)后第7日起明顯增高(P<0.05)。術(shù)后第14日，KN組尿蛋白及血肌酐水平回落至正常水平，與sham組相比無(wú)明顯差異，而KL組的尿蛋白及血肌酐水平則繼續(xù)增高(P<0.01)。
　　 2.蘇木素伊紅(HE)染色：
　　 HE染色表明KL組有明顯的腎小管上皮細(xì)胞退化、脫落及萎縮現(xiàn)象；而KN組類(lèi)似組織改變不如KL組明

14、顯；sham組未見(jiàn)上述組織改變。
　　 3.凋亡檢測(cè)：
　　 Sham組中罕見(jiàn)凋亡細(xì)胞；KL組細(xì)胞凋亡指數(shù)從術(shù)后第1日起開(kāi)始增多(P<0.05)并在術(shù)后第14日達(dá)到頂峰(P<0.01)；KN組細(xì)胞凋亡指數(shù)自術(shù)后第7日明顯增高(P<0.05)，之后維持在較高水平(P<0.05)，并未進(jìn)一步增高。與KL組相比，KN組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡指數(shù)均較低(P<0.05)。
　　 4.腎臟ROS、MDA及SOD水平：
　　

15、 與sham組相比，KL組ROS水平自術(shù)后第1日起開(kāi)始增高并維持在一個(gè)較高的水平(P<0.05)，術(shù)后第7日起KL組腎臟MDA水平增高(P<0.05)而SOD活性水平降低(P<0.05)。而KN組與sham組相比，以上指標(biāo)在各時(shí)間點(diǎn)未見(jiàn)明顯異常。
　　 5.Bax、Bcl-2、FasL基因表達(dá)：
　　 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與sham組相比，KL組Bax及FasL mRNA表達(dá)水平自術(shù)后第1天起明顯增高(P<0.0

16、5)并在術(shù)后第14天達(dá)到高峰(P<0.01)，而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)水平自術(shù)后第1天起明顯降低(P<0.05)并一直低于sham組(P<0.01)。與sham組相比，KN組Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化；而FasL mRNA表達(dá)水平自術(shù)后第7日起明顯高于sham組(P<0.05)，但仍低于KL組(P<0.05)。
　　 6.Bax、Bcl-2、cytc及FasL蛋白表達(dá)：
　　 Western結(jié)果顯示

17、，與sham組相比，KL組Bax、cytc及FasL蛋白表達(dá)水平自術(shù)后第1天起明顯增高(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平自術(shù)后第1天起明顯降低(P<0.05)。與sham組相比，KN組FasL蛋白表達(dá)水平自術(shù)后第7天起明顯增高(P<0.05)，但仍低于KL組(P<0.05)。而KN組的Bax、cytc及Bcl-2蛋白表達(dá)水平與sham組相比無(wú)明顯差異。
　　 7.caspase8、caspase9及caspase3的活性

18、：
　　 與sham組相比，KL組caspase8、caspase9及caspase3的活性自術(shù)后第一日起增高并保持在較高水平(P<0.05)。KN組caspase8活性自術(shù)后第7日起較sham組明顯增高(P<0.05)，但仍低于KL組(P<0.05)。而KN組caspase9及caspase3的活性與sham組相比無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 1.我們證實(shí)了腎臟淋巴循環(huán)障礙可以導(dǎo)致腎臟功能減退及腎臟細(xì)胞凋亡