腎淋巴循環(huán)障礙對腎臟結(jié)構(gòu)及功能影響的實驗研究.pdf

1、背景和目的： 隨著人民生活水平的提高及壽命的延長，慢性腎臟病(CKD)的發(fā)病率明顯增高。慢性腎損害所致的尿毒癥給病人帶來了極大的痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此探討慢性腎損害的原發(fā)致病因素并采取早期干預(yù)措施有重大理論意義和臨床實用價值。近年來，有關(guān)器官內(nèi)淋巴管的超微結(jié)構(gòu)及其循環(huán)障礙對組織影響的研究已有一些報道，尤其在腦、肝臟、胃腸等器官已取得了較大進(jìn)展。然而，關(guān)于腎臟毛細(xì)淋巴管的超微結(jié)構(gòu)以及循環(huán)障礙對腎臟影響的研究少見報道。早期曾有人研究過

2、短時結(jié)扎犬腎門淋巴管后，對腎功能的影響，發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)靜水壓增高，鈉水排泄改變，尿量增加，隨著時間延長，可出現(xiàn)腎間質(zhì)的彌漫性損害。那么，腎臟淋巴循環(huán)和腎臟組織結(jié)構(gòu)改變之間有著怎樣的關(guān)系，又是通過何種機(jī)制起作用呢?至今尚無人深入研究。 我們早期的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)扎大鼠腎淋巴管后，尿蛋白顯著增加，隨著時間推移腎功能逐漸減退，組織病理出現(xiàn)以腎小管間質(zhì)損傷為主的改變，包括上皮細(xì)胞崩潰脫落壞死，小管萎縮，正常結(jié)構(gòu)破壞，腎間質(zhì)纖維化，腎小球系膜細(xì)胞

3、及基質(zhì)增生等。我們推測腎淋巴循環(huán)障礙將激發(fā)腎臟纖維化與腎臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生。我們知道腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病的共同特征，幾乎是所有終末期腎病(ESRD)的最終轉(zhuǎn)歸，而腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)是腎間質(zhì)纖維化的重要發(fā)病機(jī)制之一。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程的經(jīng)典調(diào)控因子為轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族成員。SMAD家族蛋白的主要作用是介導(dǎo)TGF-β家族的信號。細(xì)胞凋亡又稱程序性的細(xì)胞死亡，隨著對細(xì)胞凋亡研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)Bcl-

4、2家族是在細(xì)胞凋亡中有重要作用的一類蛋白質(zhì)。Bcl-2家族的表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一，在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。Bcl-2和bax分別是bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因，并且bax是bcl-2活性的主要調(diào)控因子。盡管，對腎間質(zhì)纖維化和細(xì)胞凋亡的研究已較深入廣泛，但腎淋巴循環(huán)障礙是否引起腎間質(zhì)纖維化和細(xì)胞凋亡，TGF-β1/smad途徑和bax/bcl-2途徑在其中的作用如何卻仍不清楚。本課題吸

5、收國內(nèi)外研究的最新成果，結(jié)合國內(nèi)外腎臟病防治的迫切需要，通過動物試驗，用結(jié)扎腎淋巴管的方法建立腎淋巴循環(huán)障礙大鼠模型，通過觀察腎組織病理及功能變化用以證實腎淋巴循環(huán)障礙所導(dǎo)致的腎臟損害，通過對TGF-β/SMAD途徑和Bcl-2/bax途徑的相關(guān)分子蛋白的檢測，闡明其腎間質(zhì)纖維化及腎細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制，為臨床越來越多的不明原因的慢性腎損傷尋找新的原發(fā)致病因素。 研究方法： 1.鼠腎起始淋巴管的分布及形態(tài)學(xué)觀察1.1 Wi

6、star大鼠20只，雌雄不限。常規(guī)麻醉、手術(shù)開腹。每只動物取腎組織用免疫熒光雙標(biāo)法，即淋巴管標(biāo)記物Podoplanin和血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD34分別標(biāo)記淋巴管和血管，應(yīng)用Leica熒光顯微鏡在不同的通道(綠光激發(fā)光波長543nm；紅色激發(fā)光波長633nm)分別觀察并拍照，以觀察鼠腎起始淋巴管在腎臟分布。 1.2腎臟超微結(jié)構(gòu)觀察：在皮質(zhì)，髓質(zhì)及皮髓交界區(qū)取組織塊置3％戊二醛固定液內(nèi)，用透射電鏡觀察淋巴管超微結(jié)構(gòu)，包括毛細(xì)淋巴管的一般

7、特征、內(nèi)皮細(xì)胞的連接、質(zhì)膜小泡的形態(tài)和分布。 2.對大鼠腎臟結(jié)構(gòu)功能的觀察2.1將大鼠分為兩組：模型組和對照組，每組30只。用結(jié)扎腎淋巴管的方法建立了腎淋巴循環(huán)障礙大鼠模型。各組大鼠分別于術(shù)后第7、14、28、56天各處死6只。在處死前1日留取24小時尿標(biāo)本，處死日留取血標(biāo)本。尿蛋白和血清肌酐由全自動分析儀檢測。Ccr按公式：尿肌酐濃度×每分鐘尿量(ml)/血肌酐濃度計算，并以體重校正。以觀察不同時間段大鼠尿蛋白、腎功能改變。

8、 2.2腎臟組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋，切片3μm厚度，做PAS、Masson染色。在光鏡下觀察腎臟病理改變，并根據(jù)小管損傷，小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化標(biāo)準(zhǔn)作小管損傷指數(shù)，小管間質(zhì)纖維化指數(shù)(TIFI)和腎小球硬化指數(shù)(GSI)的半定量分析。 2.3留取約1mm3大小腎皮質(zhì)經(jīng)固定、包埋，切片厚50nm，觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)改變。 3.淋巴循環(huán)障礙促使腎間質(zhì)纖維化的研究假手術(shù)組和模型組大鼠分別于術(shù)后第7、14、28、56天處死。

9、留取腎組織標(biāo)本提取組織蛋白、mRNA基因和制作石蠟切片。運用Real-time PCR、Western Blot和免疫組化檢測檢測TGF-B1、Smad2/3、P-smad2/3在腎臟組織的表達(dá)。 4.腎淋巴循環(huán)障礙促使腎細(xì)胞凋亡的研究各組大鼠分別于術(shù)后第1、7、14、28天各處死6只，留取腎組織標(biāo)本提取組織蛋白、mRNA基因和制作石蠟切片。運用Real-time PCR、Western Blot和免疫組化檢測檢測Bax、Bcl

10、-2、Caspase3在腎臟組織的表達(dá)，用腎臟細(xì)胞原位凋亡(TUNEL)的方法檢測腎臟凋亡細(xì)胞。 結(jié)果： 1-鼠腎起始淋巴管的分布及形態(tài)學(xué)觀察1.1 經(jīng)免疫熒光雙重染色，光鏡下可見毛細(xì)血管呈紅色、毛細(xì)淋巴管呈綠色，區(qū)別明顯。淋巴管形態(tài)不規(guī)則，管腔大，壁薄。淋巴管主要位于富含結(jié)締組織區(qū)，大鼠腎臟皮質(zhì)淋巴管明顯多于髓質(zhì)。 1-2 電鏡下見毛細(xì)淋巴管的形狀極不規(guī)則，毛細(xì)淋巴管的管壁較薄，毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞無窗孔，基膜很

11、薄，不連續(xù)或缺如，可見細(xì)胞內(nèi)通道樣結(jié)構(gòu)，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中富含細(xì)胞器和質(zhì)膜小泡。內(nèi)皮細(xì)胞以重疊連接為主，在內(nèi)皮細(xì)胞的連接處可見有粘著裝置。毛細(xì)淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞中含有極其豐富、大小不等的質(zhì)膜小泡。質(zhì)膜小泡多數(shù)游離于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。 2.對大鼠腎臟結(jié)構(gòu)功能的觀察2.1模型組大鼠于術(shù)后第1周即出現(xiàn)明顯蛋白尿(P＜0.05)，隨時間的延長而加重；模型組大鼠血肌酐水平在第2周時開始升高，(P＜0.05)，且隨術(shù)后時間延長，有逐漸增高趨勢；模型組C

12、cr水平從術(shù)后第2周起明顯下降，以后隨著術(shù)后時間的延長，不斷下降。 2.2模型組大鼠出現(xiàn)明顯的組織病理改變，腎小管擴(kuò)張明顯，伴上皮細(xì)胞空泡變性，部分小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞崩潰脫落，小管結(jié)構(gòu)不完整。隨術(shù)后時間延長出現(xiàn)腎小管萎縮，間質(zhì)面積增寬，小管和間質(zhì)結(jié)構(gòu)消失，其中可見大量纖維組織增生。腎小球系膜區(qū)可見系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生。小管損傷指數(shù)，小管間質(zhì)纖維化指數(shù)(TIFI)和腎小球硬化指數(shù)(GSI)較對照組明顯增高，并隨病程逐漸進(jìn)展。 2.3

13、電鏡下觀察模型組于造模后1周即出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞、腎小球足細(xì)胞水腫，胞質(zhì)內(nèi)空泡數(shù)目增加，線粒體腫脹，部分嵴消失部分線粒體嵴消失呈空泡狀；足突融合、變平；系膜增生插入，基質(zhì)呈高電子密度。 3.淋巴循環(huán)障礙促使腎間質(zhì)纖維化的研究3.1 免疫組化顯示，模型組大鼠在小管上皮及系膜區(qū)的TGF-β1、Smad2/3表達(dá)明顯增強(qiáng)，在小管上皮細(xì)胞更為明顯。Col I在腎間質(zhì)及腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)明顯增高，而腎小球無明顯變化。p-Smad2/3主

14、要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，在腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)也可見較強(qiáng)的p-Smad2/3的表達(dá)。 3.2 Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)模型組TGF-β1、Smad2/3的蛋白表達(dá)量較對照組明顯增加(P＜0.05)，在第1周開始就有p-Smad2/3蛋白表達(dá)，第2周后持續(xù)增高，以后維持在較高水平(P＜0.05)。 3.3 Real-time PCR的檢測顯示Col I、TGF-β1、Smad2、Smad 3的mRNA均于術(shù)后第1周開

15、始增高，分別為同期對照組的4.5、1.6、1.7、1.8倍(P＜0.05)。4.腎淋巴循環(huán)障礙促使腎細(xì)胞凋亡的研究4.1應(yīng)用TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)，在模型組大鼠陽性著色細(xì)胞顯著增加，且細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在擴(kuò)張或萎縮的腎小管；模型組的凋亡指數(shù)在術(shù)后第一天開始升高(p＜0.05)，在第14天達(dá)到高峰(p＜0.01)。 4.2免疫組化提示，模型組的Bax和caspase-3表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要位于小管間質(zhì)，尤其在遠(yuǎn)端小管。相反， Bcl-2的

16、表達(dá)明顯減弱。 4.3 Western blot分析顯示，模型組大鼠Bax蛋白表達(dá)水平明顯增加，在術(shù)后第14天達(dá)到高峰(p＜0.01)，以后維持緩慢增高趨勢。然而Bcl-2蛋白表達(dá)從術(shù)后第一天開始明顯下降。由此，Bax/Bcl-2比值明顯增高?？俢aspase-3表達(dá)明顯高于對照組(p＜0.01)，且其活化片段(17-kDa)表達(dá)也明顯增高。 4.4 Real-time PCR顯示在所有時間段，模型組大鼠bax和casp

17、ase-3的mRNA表達(dá)顯著增高，而bcl-2 mRNA表達(dá)卻明顯下降(p＜0.05)。同樣Bax/Bcl-2比值也較對照組明顯增高。 結(jié)論： 1.大鼠腎臟淋巴系統(tǒng)內(nèi)大量質(zhì)膜小泡和通道樣結(jié)構(gòu)的存在，正是腎臟轉(zhuǎn)運大分子物質(zhì)和組織液進(jìn)入淋巴循環(huán)的生理基礎(chǔ)。 2.腎淋巴循環(huán)障礙對腎臟結(jié)構(gòu)和功能有著明顯的影響，腎臟功能減退和結(jié)構(gòu)損害隨循環(huán)障礙時間的延長而加重。 3.在腎淋巴循環(huán)障礙導(dǎo)致的小管間質(zhì)纖維化過程中，TGF-β1