雷藤內(nèi)酯醇對淋巴瘤Raji細(xì)胞凋亡及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的影響研究.pdf

1、目的：
　　 本課題以人淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞為體外模型，研究雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TPL)對Raji細(xì)胞的生長抑制作用，分析TPL對Raji細(xì)胞p15基因及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMT)的影響。希望通過對雷公藤內(nèi)酯醇抑制Raji細(xì)胞生長的機(jī)理研究，為淋巴瘤的治療提供新的思路和策略。
　　 方法：
　　 (1)分別用0、5、10、15、20ng/ml T

2、PL作用Raji細(xì)胞24h、48h、72好，采用CCK-8法研究TPL對Raji細(xì)胞增殖作用的影響。
　　 (2)分別用不同濃度TPL處理Raji細(xì)胞24h，采用瑞氏染色光學(xué)顯微鏡觀察TPL作用后Raji細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　 (3)用不同濃度TPL處理Raji細(xì)胞24h，采用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡的特征性梯形條帶。
　　 (4)用不同濃度TPL處理Raji細(xì)胞24h，采用Annexin-V/PI雙染流式細(xì)

3、胞儀技術(shù)檢測凋亡的細(xì)胞量。
　　 (5)用不同濃度TPL處理Raji細(xì)胞24h，采用PI染色流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞周期。
　　 (6)用不同濃度TPL，處理Raji細(xì)胞24h，采用熒光定量RT-PCR檢測p15、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)TPLP對人淋巴瘤Raji細(xì)胞有抑制增殖作用。5、10、15、20ng/ml TPL作用Raji細(xì)胞24h，增殖抑

4、制率分別為：(11.02±2.00)％、(17.97±3.13)％、(31.07±3.90)％和(48.88±5.66)％；5、10、15、20ng/ml TPL作用Raji細(xì)胞48h，增殖抑制率分別為：(33.30±4.10)％、(48.15±2.02)％、(59.55±4.34)％和(69.05±4.78)％；5、10、15、20ng/ml TPL作用Raji細(xì)胞72h，增殖抑制率分別為(48.05±4.82)％、(65.90±7.

5、83)％、(69.74±4.06)％和(81.05±3.99)％。24h、48h、72h半數(shù)抑制率(IC50)分別為：23.68 ng/ml、10.04 ng/ml和5.50ng/ml。不同濃度TPL處理Raji細(xì)胞，具有不同的增殖抑制作用(24h，F(xiàn)=76.54，P<0.05；48h，F(xiàn)=75.80，P<0.05；72h，F(xiàn)=32.10，P<0.05)。Raji細(xì)胞經(jīng)TPL作用不同時間，其增殖抑制程度亦不同(5ng/ml，F(xiàn)=147.

6、25，P<0.05；10ng/ml，F(xiàn)=174.86，P<0.05；15ng/ml，F(xiàn)=119.31，P<0.05；20ng/ml，F(xiàn)=56.02，P<0.05)。TPL抑制Raji細(xì)胞增殖呈劑量依賴關(guān)系(24h，R=0.95，P<0.05；48h，R=0.96，P<0.05；72h，R=0.90，P<0.05)及時間依賴關(guān)系(5ng/ml，R=0.97，P<0.05；10ng/ml，R=0.97，P<0.05；15ng/ml，R=0.

7、94，P<0.05；20ng/ml，R=0.94，P<0.05)。
　　 (2)5、10、15、20ng/mlTPL處理Raji細(xì)胞24h，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征：光鏡下可見凋亡細(xì)胞胞體固縮、核固縮、核碎裂及凋亡小體。
　　 (3)5、10、15、20ng/mlTPL處理Raji細(xì)胞24h，在DNA凝膠電泳中均顯示典型的凋亡DNA梯形條帶(DNA Ladder)。
　　 (4)5、10、15、20ng/

8、mlTPL處理Raji細(xì)胞24h，以Annexin VFITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞膜外側(cè)磷脂酰絲氨酸(PS)的含量，Annexin V(+)，PI(-)細(xì)胞百分比分別為：(0.10±0.10)％，(5.70±1.35)％，(7.07±0.75)％，(8.50±0.56)％，(11.63±1.07)％，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=70.23，P<0.05)。發(fā)生PS轉(zhuǎn)位的細(xì)胞百分比與藥物作用濃度正相關(guān)(r=0.95；P<0.05)。

9、>　　 (5)5、10、15、20ng/ml TPL處理Raji細(xì)胞24h，以PI染色檢測細(xì)胞周期，隨藥物濃度增加，亞G1期及G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加，同時S及G2/M期細(xì)胞比例逐漸減少。與對照組比較其差異有顯著性意義(亞G1期，F(xiàn)=138.86，P<0.05；G0/G1期，F(xiàn)=99.58，P<0.05；S期，F(xiàn)=117.49，P<0.05；G2/M期，F(xiàn)=14.66，P<0.05)。亞G1期細(xì)胞百分率增加呈藥物濃度依賴(r=0.

10、98，P<0.05)。S期細(xì)胞百分率與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)(r=0.98，P<0.05)。
　　 (6)Raji細(xì)胞p15基因mRNA弱表達(dá)或不表達(dá)(陽性率13.30％)，經(jīng)20 ng/mlTPL作用24h后，Raji細(xì)胞p15基因mRNA表達(dá)增加(陽性率53.30％)，差異具顯著意義(F=5.40，P<0.05)。
　　 (7)5、10、15、20ng/ml TPL處理Raji細(xì)胞24h，對DNMTI、DNMT3A、DNM

11、T3B mRNA有下調(diào)作用，且有劑量依賴(r值分別為-0.91、-0.96、-0.95，P值均<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)5-20ng/ml劑量范圍內(nèi)的TPL對Raji細(xì)胞具有增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡作用，且呈劑量、時間依賴性。
　　 (2)TPL對Raji細(xì)胞的生長抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用可能與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。
　　 (3)TPL通過上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因p15 mRNA表達(dá)，恢復(fù)該基因功能，使細(xì)

12、胞周期阻止于G0/G1期，可能是其誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡機(jī)制之一。
　　 (4)TPL對Raji細(xì)胞DNMT1、DNMT3A、DNMT3B在mRNA水平有下調(diào)作用，且有劑量依賴。
　　 (5)TPL下調(diào)Raji細(xì)胞DNMT1、DNMT3A、DNMT3a mRNA表達(dá)，可能通過p15基因去甲基化，恢復(fù)p15基因功能，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能是TPL誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制之一。TPL對Raji細(xì)胞p15基因的去