單味中藥脫色及復(fù)方含藥血清對體外培養(yǎng)人A375黑素瘤細(xì)胞黑素代謝影響的研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 皮膚色素代謝障礙與多種體內(nèi)因素和環(huán)境因素密切相關(guān)，色素障礙性疾病（如白癜風(fēng)、黃褐斑）易診而難治。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，有關(guān)色素代謝的研究迅猛開展。國內(nèi)外學(xué)者積極探索色素代謝的機(jī)制及影響因素，闡述中藥調(diào)節(jié)色素代謝的作用機(jī)制，為治療色素代謝性疾病尋找安全、有效的中藥成分或方劑，對有關(guān)中藥與色素的代謝方面進(jìn)行了廣泛的研究，但目前對其作用機(jī)理與規(guī)律仍未能得到深入的科學(xué)闡述，因此臨床上缺乏較為理想治療手段及

2、方法。目前許多中藥對酪氨酸酶活性、黑素細(xì)胞代謝的影響已經(jīng)有了初步的揭示，研究的方法技術(shù)亦日益成熟。但是，大多數(shù)研究都局限于觀察單味中藥或復(fù)方中藥的研究上，鮮有從中藥色象理論的角度設(shè)計較為系統(tǒng)的多層次的研究，有關(guān)色象中藥對黑素代謝影響與干預(yù)機(jī)理的研究尚為缺乏。吾師楊柳教授通過長期的臨床探索與理論研究，在取象比類思維啟示下創(chuàng)立了治療色素性皮膚病的中藥色象理論，形成了具有鮮明特色的理論和治療方法。認(rèn)為中藥顏色與色素性皮膚病的療效有一定的相關(guān)性

3、，并首次將這種表明藥材顏色與療效相關(guān)的現(xiàn)象稱之為“中藥色象”，將這種治療色素病色效相關(guān)的中藥，稱之為“色象中藥”。初步研究中藥藥材顏色與色素性皮膚病的療效之間的關(guān)系，并取得了一定的成果。我們的初步研究結(jié)果和以往學(xué)者的研究表明對藥材本身的顏色與藥效存在一定的關(guān)系，因此對中藥色象理論的進(jìn)一步研究，尤其是應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)研究方法技術(shù)，對色象中藥調(diào)節(jié)與干預(yù)色素代謝機(jī)理的現(xiàn)代分子學(xué)研究是非常有必要的。
　　 另外，白癜風(fēng)作為色素脫失性疾病的典

4、型病種，臨床上易診而難治。中醫(yī)藥治療白癜風(fēng)具有鮮明的特色，強(qiáng)調(diào)證候分型與辨證論治。但目前白癜風(fēng)的證候分型及方藥種類繁多，缺乏統(tǒng)一性和標(biāo)準(zhǔn)化。此外，在臨床實踐中許多白癜風(fēng)患者出現(xiàn)“無癥可辨”或“少癥如何辨”的情況，基本除了皮膚出現(xiàn)白斑以外，沒有其他特殊的伴隨癥狀。對此，吾師提出了以“祛風(fēng)、活血、補(bǔ)腎”為基本治則，并結(jié)合分期論治的治療方案。
　　 基于此，本研究通過查閱大量的文獻(xiàn)資料及臨床資料，并結(jié)合臨床實踐經(jīng)驗，在以往研究的基礎(chǔ)上

5、，篩選出中醫(yī)傳統(tǒng)治驗及現(xiàn)代研究表明治療色素病有效的使用頻率高的黑白兩類中藥共10味，以目前研究技術(shù)較為成熟的酪氨酸酶、細(xì)胞增殖及黑素合成作為觀察指標(biāo)，研究單味中藥經(jīng)活性炭脫色后對體外培養(yǎng)的人A375黑素瘤細(xì)胞黑素代謝的影響，以及采用中藥血清學(xué)的方法研究4種具有不同功效的復(fù)方含藥血清對黑素代謝的影響，進(jìn)一步探討色象中藥與色素代謝的相關(guān)性，為色象理論及臨床辨證用藥提供科學(xué)依據(jù)，為以后白癜風(fēng)的辨證治療提供實驗依據(jù)，同時為中醫(yī)藥治療色素病的研究

6、提供新的思路，以有效地指導(dǎo)臨床。
　　 方法與內(nèi)容：
　　 1、通過查閱大量的文獻(xiàn)資料及臨床資料，并結(jié)合臨床實踐經(jīng)驗，在以往的研究基礎(chǔ)上，篩選出中醫(yī)傳統(tǒng)治驗及現(xiàn)代研究表明治療色素病有效的使用頻率高的中藥，依據(jù)飲片的外在顏色分為黑（深色）、白（淺色）兩組，每組各選5味藥作為代表藥，制備各單味中藥水提液，取上述中藥水提取液100ml，用紫光分光光度法進(jìn)行測定吸光度值，采用正交試驗法對每味中藥的脫色工藝進(jìn)行篩選，以最佳脫色條件

7、進(jìn)行脫色后取上清液過濾后備用，并用不含胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使藥物終質(zhì)量濃度為10μg/ml。
　　 2、參照醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)及中藥血清學(xué)的方法，制備四種不同功效配伍的復(fù)方含藥血清，并用不含胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使含藥血清的終濃度為5％、10％、20％、30％，并以此四種濃度進(jìn)行研究。
　　 3、應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)技術(shù)，將人A375黑素瘤細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng)。采用多巴速率氧化法測定黑白兩組中藥水提取液脫色前后、四種不同功

8、效配伍的復(fù)方含藥血清在不同濃度對細(xì)胞中酪氨酸酶活性的影響，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定黑白兩組中藥水提取液脫色前后、四種不同功效配伍的復(fù)方含藥血清在不同濃度對細(xì)胞增殖的影響;采用NaOH裂解法測定黑白兩組中藥水提取液脫色前后、四種不同功效配伍的復(fù)方含藥血清在不同濃度對細(xì)胞中黑素合成含量的影響。每種藥物每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次，并設(shè)對照組:單純培養(yǎng)基組、中藥對照組（培養(yǎng)基+中藥）和空白對照組（培養(yǎng)基+細(xì)胞）。
　　 3、

9、應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，分別采用單因素方差分析的Dunnett檢驗和析因設(shè)計資料的方差分析對單味中藥和復(fù)方含藥血清各組實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理與分析，數(shù)據(jù)均以（x）±s表示，以P≤0.05時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、單味中藥調(diào)節(jié)黑素代謝測定結(jié)果:
　　 ①未經(jīng)活性炭脫色的中藥中，制首烏、補(bǔ)骨脂、丹參、雞血藤、墨旱蓮、桃仁對TYR活性具有激活作用（P≤0.05或P≤0.01）;茯苓、白芷、

10、白芨對TYR活性具有抑制作用（P≤0.05或P≤0.01）。而經(jīng)活性炭脫色后，制首烏、墨旱蓮對TYR活性無激活作用(P＞0.05)，丹參、雞血藤、補(bǔ)骨脂對TYR活性的激活作用明顯降低，與未脫色組比較，差異具有顯著性（P≤0.05或P≤0.01）。桃仁、茯苓、白芷、白芨、白術(shù)脫色前后比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 ②與空白對照組比較，未經(jīng)活性炭脫色的中藥中，制首烏、補(bǔ)骨脂、丹參、雞血藤、桃仁對黑素細(xì)胞增殖具有促進(jìn)

11、作用(P≤0.05或P≤0.01);白芷、白芨、白術(shù)對黑素細(xì)胞增殖具有抑制作用(P≤0.01)。而經(jīng)活性炭脫色后，丹參、雞血藤對黑素細(xì)胞增殖無促進(jìn)作用（P＞0.05），白術(shù)、白芨、補(bǔ)骨脂對黑素細(xì)胞抑制或促進(jìn)作用明顯降低，與未脫色組比較，差異具有顯著性(P≤0.05)，茯苓脫色后對黑素細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，與未脫色組比較，差異具有顯著性(P≤0.01)，桃仁、白芷、墨旱蓮、白術(shù)脫色前后比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　

12、 ③未經(jīng)活性炭脫色的中藥中，補(bǔ)骨脂、丹參、雞血藤、桃仁對黑素細(xì)胞合成具有促進(jìn)作用(P≤0.01);白芨、白術(shù)對黑素細(xì)胞合成具有抑制作用(P≤0.05)。而經(jīng)活性炭脫色后，桃仁、雞血藤對黑素細(xì)胞合成無促進(jìn)作用(P＞0.05)，丹參、補(bǔ)骨脂對黑素細(xì)胞合成作用明顯降低，與未脫色組比較，差異具有顯著性（P≤0.05或P≤0.01），墨旱蓮、茯苓脫色后對黑素細(xì)胞合成具有促進(jìn)作用，與未脫色組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義或具有顯著性（P≤0.01），白芷

13、脫色后對黑素細(xì)胞合成具有抑制作用，與未脫色組比較，差異具有顯著性(P≤0.01)，制首烏、白芨、白術(shù)脫色前后比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2、復(fù)方含藥血清對黑素瘤細(xì)胞黑素代謝測定結(jié)果:
　　 ①相應(yīng)濃度各方之間比較，含藥血清濃度為5％時，與空白血清對照組比較，Ⅰ方、Ⅱ方、Ⅲ方對酪氨酸酶活性激活作用不顯著，僅Ⅵ方含藥血清對酪氨酸酶活性有顯著激活作用(P=0.014＜0.05)，Ⅵ方對酪氨酸酶的激活作用顯

14、著高于Ⅰ方、Ⅱ方（P=0.01和P=0.004≤0.01），與Ⅲ方作用無顯著差異(P=0.233＞0.05);含藥血清濃度為10％時，各組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.124＞0.05)。含藥血清濃度為高濃度(20％-30％)時，與相應(yīng)濃度空白血清對照組比較，Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ方對A375細(xì)胞酪氨酸酶活性均有激活作用，以Ⅵ方作用最顯著(P＜0.001)，且與相應(yīng)濃度的其它三方相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.001）。
　　 相應(yīng)復(fù)方

15、各濃度間比較:Ⅰ方各濃度間比較，隨著濃度的增加，中藥對酪氨酸酶的激活作用增強(qiáng)，20％與30％含藥血清濃度對酪氨酸酶活性的影響無顯著差異(P=0.203＞0.05)，與5％和10％含藥血清濃度激活作用比較，有顯著差異(P＜0.01)。Ⅱ方各濃度間比較，5％、20％、30％含藥血清濃度對酪氨酸酶的激活作用與10％含藥血清濃度相比，均有顯著差異（P≤0.05或P≤0.01）,三種濃度間無顯著差異(P=0.484＞0.05)。Ⅲ、Ⅵ方各濃度間比

16、較差異均有顯著意義（P≤0.01），中藥對酪氨酸酶的激活作用隨著含藥血清濃度的增加而增強(qiáng)。
　　 ②相應(yīng)濃度各復(fù)方之間比較，含藥血清濃度為低濃度5％～10％時，與空白血清對照組比較，各方對黑素增殖作用不顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。含藥血清濃度為20％時，與空白血清對照組比較，復(fù)方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ方對黑素增殖均有明顯促進(jìn)作用，以Ⅵ方作用最顯著(P＜0.001)，且與同血清濃度的其它三方相比，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0

17、.001);含藥血清濃度為30％時，與空白血清對照組比較，Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ方對A375黑素瘤細(xì)胞黑素增殖有顯著促進(jìn)作用（P≤0.05或P≤0.01），各方之間比較，Ⅰ方、Ⅲ方與Ⅵ方比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.419＞0.05)，Ⅱ方與Ⅵ方相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001＜0.01)。
　　 相應(yīng)復(fù)方各濃度間比較:Ⅰ方各濃度間比較，隨著濃度的增加，中藥對黑素增殖的促進(jìn)作用增強(qiáng)，20％與30％含藥血清濃度對黑素增殖的促進(jìn)作用無顯

18、著差異(P=0.831＞0.05)，與5％和10％含藥血清濃度促增殖作用比較，均有顯著差異(P≤0.01)。Ⅱ方各濃度間比較，10％、20％、30％含藥血清濃度對黑素增殖的促進(jìn)作用均高于5％含藥血清濃度(P≤0.01)，其中20％含藥血清濃度促進(jìn)作用最強(qiáng)，與其它濃度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.01）。Ⅲ方、Ⅵ方各濃度間比較，均以20％含藥血清濃度促黑素增殖作用最強(qiáng)，與其它含藥血清濃度比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

19、　　 ③中藥各復(fù)方之間促進(jìn)黑素合成作用比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，中藥含藥血清均能在一定程度上促進(jìn)黑素合成，各復(fù)方對黑素合成促進(jìn)作用高于空白血清對照組。復(fù)方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ方之間比較，三者對黑素合成促進(jìn)作用無顯著差異(P=0.480＞0.05)，Ⅵ方對黑素合成促進(jìn)作用顯著高于其它組。
　　 復(fù)方中藥不同含藥血清濃度對黑素合成促進(jìn)作用比較差異有顯著差異(P＜0.001)，隨著含藥血清濃度的增加，各方對黑素合成促進(jìn)作用增

20、強(qiáng)，10％含藥血清濃度對黑素合成的促進(jìn)作用顯著高于5％含藥血清濃度，20％與30％含藥血清濃度對黑素合成的促進(jìn)作用顯著高于5％、10％含藥血清濃度，此兩種濃度間比較無顯著差異(P=0.915＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、經(jīng)活性炭脫色后，黑色（深色）、白色（淺色）中藥大部分失去或降低了對黑素代謝的促進(jìn)或抑制作用，其中黑色藥物更顯著。說明藥材顏色與色素代謝調(diào)節(jié)存在一定的相關(guān)性。
　　 2、具有祛風(fēng)、活血和補(bǔ)