高壓干燥保存小鼠心臟的機(jī)制研究.pdf

1、目的：終末期心臟病的治療方法中，心臟移植無論是從病人的治愈率還是病人的術(shù)后生存時(shí)間來看，都是無可非議的，甚至是最好的。等待接受心臟移植的患者數(shù)量每年都在增加。供者來源少，受者數(shù)量卻增加，對供心的要求就越來越急迫。常用心臟保存液保存離體心臟限制在4～6 h[1,2]，離體供心保存時(shí)間短，限制了心臟移植手術(shù)的開展。通過改良保存液的成分，如加入鈣離子、抗氧化劑等[3]可以減輕保存過程中對供心的損傷，但效果仍不理想。如若找到一種全新的離體器官（

2、心臟）保存方法，在保證保存質(zhì)量的同時(shí)大大延長保存時(shí)間，可緩解目前供心緊缺的現(xiàn)狀，造福廣大復(fù)雜先天性心臟病和終末期心臟病的患者。本實(shí)驗(yàn)課題采用一氧化碳(Carbon monoxide，CO)高壓干燥保存這一全新的器官保存方法，用以保存小鼠離體供心，觀察一氧化碳和氧氣混合氣體的高壓干燥保存方式是否優(yōu)于目前常用的康斯特保護(hù)液(HistidiBeTryptophan Ketoglurate Solution，HTK液)浸泡保存，并對該保存方式的

3、可能作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　方法一：SPF級C57BL/6雄性小鼠，84只。供體鼠4～6周齡，體重（21±2）g，共48只;受體鼠6～8周齡，體重（29±2）g，共36只，所有實(shí)驗(yàn)用鼠均購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)。供體鼠隨機(jī)分為4組，每組12只:空白對照組、即刻移植組、HTK浸泡保存24移植組(HTK組)及CO高壓干燥保存24 h移植組（CO組）。受體鼠隨機(jī)分為3組，每組12只:即刻移植受體組、HTK受體組及高壓干

4、燥受體組。
　　供心處理:空白對照組取心后不做移植，馬上取材進(jìn)行相關(guān)檢測;HTK保存組則是15 mL4℃HTK液中保存24 h;高壓干燥保存組則是處理完供心后懸掛于已預(yù)冷至4℃的干燥高壓保存罐內(nèi)。往罐內(nèi)注入800 hPa的CO及3，200 hPa的O2，密封后將罐置于4℃冰箱中保存24 h，注意高壓灌內(nèi)氣體變化并及時(shí)補(bǔ)充氣體。
　　同系小鼠頸部異位心臟移植模型建立:受體鼠6～8周齡，按供體鼠處理方法麻醉滿意后仰臥位固定。采用

5、改良cuff方法進(jìn)行小鼠異位心臟移植術(shù)。分離靜脈殘端多于組織，將靜脈殘端修正后穿入靜脈套管，然后后翻呈袖套樣套于套管壁上，10-0絲線套扎固定。移植后觀察供心2h，記錄供心復(fù)跳情況質(zhì)地及顏色變化等。記錄供心復(fù)跳率;依據(jù)復(fù)灌后供心的收縮強(qiáng)度、顏色及供心的硬度進(jìn)行移植物活力評分，2h觀察完畢后，縫皮，受體鼠置于電熱毯保溫、獨(dú)籠飼養(yǎng)。
　　結(jié)果：供心移植后復(fù)跳率結(jié)果為:即刻移植組有9只復(fù)跳(n=12)、HTK保存組有1只復(fù)跳(n=12)

6、，高壓干燥保存組有8只復(fù)跳(n=12)，復(fù)跳率結(jié)果分別為75％、8.3％、66.7％，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=12.667，P=0.002＜0.01)，調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)α'=α/3=0.0167，多樣本間行兩兩比較，即刻移植組與高壓干燥保存組復(fù)跳率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.653＞0.0167)，高壓干燥保存組復(fù)跳率明顯高于HTK液保存組(P=0.003＜0.0167)，即刻移植組復(fù)跳率明顯高于HTK保存組(P=0.001＜0.0167

7、)。各組移植物活力評分分別用中位數(shù)、第1四分位數(shù)(P25％)及第3四分位數(shù)(P75％)表示，即刻移植組、HTK保存組及高壓干燥保存組活力評分分?jǐn)?shù)為4.5(4.0～4.5)、0.75(0.5～1.0)、2.5(2.0～2.875)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與即刻移植組移植物功能評分比較，HTK保存組、高壓干燥保存組降低(P＜0.01)。高壓干燥保存組移植物功能評分高于HTK保存組(P＜0.01)。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)

8、結(jié)果:空白對照組、即刻移植組、HTK組、CO組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量分別為（0.125±0.03）、(1.243±0.20)、（0.157±0.06）、（0.867±0.18），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=187，P＜0.05）。組間行兩兩比較，LC3-Ⅱ蛋白在即刻移植組表達(dá)最高，空白對照組和HTK組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CO組表達(dá)高于HTK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)?？瞻讓φ战M、即刻移植組、HTK組、CO組B

9、cl-2蛋白表達(dá)量分別為（0.187±0.018）、（2.065±0.319）、（0.261±0.075）、（2.058±0.292），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=280，P＜0.05）。Bcl-2蛋白在即刻移植組表達(dá)最高，CO組和即刻移植組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CO組表達(dá)高于HTK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果，空白對照組心肌細(xì)胞染色均一，間質(zhì)未見水腫，即刻移植組供心，心肌結(jié)構(gòu)完整

10、，間質(zhì)稍水腫但無炎細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出，HTK組供心，心肌細(xì)胞變性、細(xì)胞間質(zhì)水腫，間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出，CO組供心細(xì)胞排列致密，結(jié)構(gòu)基本完整，染色比較均勻，間質(zhì)可見少量的中性粒細(xì)胞浸潤，無明顯的紅細(xì)胞滲出。
　　方法二：SPF級C57BL/6小鼠，雄性，60只。供體鼠4～6周齡，36只，體質(zhì)量21±2 g;受體鼠6～8周齡，24只，體質(zhì)量29±2 g，均購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)，供體鼠隨機(jī)分為3組，

11、每組12只，為空白對照組、HTK浸泡保存16h移植組（HTK組）及CO高壓干燥保存16h移植組（CO組）。受體鼠隨機(jī)分為2組，每組12只，分組如下:HTK保存受體組及高壓干燥保存受體組。
　　供心處理空白對照組取心后不做移植，馬上取材進(jìn)行相關(guān)檢測;HTK保存組則是15mL4℃HTK液中保存16h;高壓干燥保存組則是處理完供心后懸掛于已預(yù)冷至4℃的干燥高壓保存罐內(nèi)。往罐內(nèi)注入400hPa的CO及1，600hPa的02，密封后將罐置于

12、4℃冰箱中保存16h，注意高壓灌內(nèi)氣體變化并及時(shí)補(bǔ)充氣體。
　　同系小鼠心臟腹部異位移植模型建立:6～8周齡小鼠作為受體鼠，麻醉滿意后仰臥位固定在手術(shù)臺上，顯微鑷游離腹主動(dòng)脈血管及下腔靜脈血管，顯微血管夾夾閉所移植部位的血管的近心端及遠(yuǎn)心端。將供體心臟放在受體小鼠腹腔右側(cè)，10-0尼龍線將受體小鼠腹主動(dòng)脈與供體心的升主動(dòng)脈作端側(cè)吻合，受體鼠下腔靜脈與供體心肺動(dòng)脈血管作端側(cè)吻合。移植后的供心2h，記錄供心復(fù)跳情況質(zhì)地及顏色變化等。依

13、據(jù)開放血管夾恢復(fù)血流后供心的搏動(dòng)情況來記錄供心復(fù)跳率;進(jìn)行移植物活力評分。2h觀察完畢后，縫皮，受體鼠置于電熱毯保溫、獨(dú)籠飼養(yǎng)。
　　結(jié)果：供心移植后復(fù)跳率結(jié)果為:HTK保存組有3只復(fù)跳(n=12)，高壓干燥保存組有10只復(fù)跳(n=12)，復(fù)跳率結(jié)果分別為25％、83.3％，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012＜0.05)，CO組供心復(fù)跳率高于HTK組。移植物活力評分結(jié)果，各組移植物活力評分分別用中位數(shù)、第1四分位數(shù)(P25％)及

14、第3四分位數(shù)(P75％)表示，HTK保存組及高壓干燥保存組活力評分分?jǐn)?shù)為1.30(0.963～1.54)、3.50(3.125～3.938)，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，CO組移植物功能優(yōu)于HTK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.447，P＜0.01)。RT-PCR檢測結(jié)果HTK組、CO組TNF-α的基因表達(dá)的相對單位為(5.095±0.421)、（3.602±0.219），HTK組表達(dá)較CO組高，t=10.902，P

15、＜0.01，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HTK組、CO組IL-1β基因表達(dá)的相對單位為（4.924±0.825）、（2.891±0.278），HTK組表達(dá)較CO組高，t=8.084，P＜0.01，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HTK組、CO組IL-6基因表達(dá)的相對單位為（5.345±0.667）、(3.033±0.320)，HTK組表達(dá)較CO組高，t=10.821，P＜0.01，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HTK組、CO組ICAM-1基因表達(dá)的相對單位為(4.892±

16、0.817)、(3.073±0.524)，HTK組表達(dá)較CO組高，t=6.493，P＜0.01，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HTK組、CO組IL-10基因表達(dá)的相對單位為（3.617±0.419）、（7.190±1.048），CO組表達(dá)較HTK組高，t=10.971，P＜0.01，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果，空白對照組心肌細(xì)胞染色均一，結(jié)構(gòu)完整， HTK組供心，心肌細(xì)胞變性，間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出，CO組供心細(xì)胞排