紅細(xì)胞冰凍干燥保存研究.pdf

1、目前，紅細(xì)胞保存為4℃下的短期保存和-80℃或-196℃深低溫長(zhǎng)期保存，前者保存期為35天-42天，由于保存期短，往往造成大量紅細(xì)胞的浪費(fèi)。后者保存期可長(zhǎng)達(dá)10年，但應(yīng)用臨床需要洗滌，耗時(shí)費(fèi)力，保存費(fèi)用昂貴，僅用于稀有血型的保存。現(xiàn)今的紅細(xì)胞保存方法，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床急救和突發(fā)事件或?yàn)?zāi)害事故的救援。由于凍干紅細(xì)胞為固體干粉劑，能在常溫下保存，性能穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)，輸注方便，保存費(fèi)用低廉，便于運(yùn)輸減少了震蕩溶血等優(yōu)點(diǎn)，紅細(xì)胞冰凍干燥保存已

2、成為近期研究的熱點(diǎn)。 從上世紀(jì)60年代末，科學(xué)家開始了對(duì)凍干紅細(xì)胞的研究，歷經(jīng)30多年，收效甚微。低溫和干燥對(duì)紅細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白外漏是影響紅細(xì)胞凍干成功的最大障礙。科學(xué)家[1]從一些耐低溫和干旱的微生物、低溫休眠動(dòng)物和耐干旱植物中得到了靈感。這些抗干旱生物體，在脫水達(dá)90％仍能生存，遇水后恢復(fù)正常的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，此類微生物在脫水時(shí)，體內(nèi)可分泌大量的二糖，尤其是海藻糖，海藻糖可占其干燥體重的20％。海藻糖是葡萄糖的

3、二聚體，是一種非還原性二糖，化學(xué)性質(zhì)十分穩(wěn)定，無(wú)任何毒副作用，在低溫、干燥狀態(tài)下對(duì)生物材料有保護(hù)作用，能穩(wěn)定生物膜，是低溫生物領(lǐng)域最佳的保護(hù)劑，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、器官和各種組織的保存中。 科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖只有分布于細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)，且達(dá)到一定的濃度，才能在低溫和干燥狀態(tài)下發(fā)揮生物學(xué)保護(hù)作用。而海藻糖一般不能透過(guò)細(xì)胞膜，如何將海藻糖導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)低溫工作者是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。BeattieGM(1997)發(fā)現(xiàn)胰島分泌細(xì)胞在冰點(diǎn)以上

4、時(shí)具有膜脂相變現(xiàn)象，利用膜相變時(shí)，膜分子之間的空隙增大，將海藻糖成功的導(dǎo)入胰島細(xì)胞。Guo和Puhlev等人(2000)通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法使人的成纖維細(xì)胞表達(dá)了編碼6-磷酸-海藻糖合成酶和6-磷酸-海藻糖磷酸酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性海藻糖可以提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞的干燥耐受性。AliEroglu(2000)等人采用金黃色葡萄球菌a-溶血素的基因突變體在人成纖維細(xì)胞膜和角質(zhì)細(xì)胞膜上打孔的方法使海藻糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后進(jìn)行深低溫保存。CroweJH(200

5、1)等人發(fā)現(xiàn)血小板通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用可以將海藻糖分子吸收到細(xì)胞內(nèi)，吸收效率達(dá)到50％以上。Roser(2001)通過(guò)電子打孔的方法，使海藻糖充分進(jìn)入細(xì)胞，然后在37℃下于干燥機(jī)上進(jìn)行干燥處理。Eroglu等人(2002)通過(guò)顯微注射的方法將海藻糖注射入人卵母細(xì)胞內(nèi)，然后再進(jìn)行低溫保存。Oliver等人(2004)利用間充質(zhì)干細(xì)胞的液相內(nèi)吞作用將海藻糖導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。Satpathy等人(2004)綜合前人的研究和紅細(xì)胞本身的特點(diǎn)，利用滲透非平

6、衡和磷脂相變相結(jié)合的辦法將海藻糖導(dǎo)入紅細(xì)胞內(nèi)。海藻糖成功的導(dǎo)入紅細(xì)胞內(nèi)，將為紅細(xì)胞的冷凍干燥保存，奠定了基礎(chǔ)。 Satpathy等人(2004)將海藻糖負(fù)載的紅細(xì)胞進(jìn)行凍干保存，血紅蛋白回收率達(dá)59％，且凍干紅細(xì)胞的各項(xiàng)生理功能正常。為紅細(xì)胞的臨床輸注，邁出了重要的一步。 目的： 1、研究海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞的方法：篩選海藻糖負(fù)載液的最佳濃度；研究溫度和時(shí)間對(duì)海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞的影響，篩選最佳溫度和時(shí)間組合條件；研究苯

7、甲醇對(duì)海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞的影響，篩選最佳的苯甲醇負(fù)載液濃度。通過(guò)負(fù)載紅細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度、負(fù)載過(guò)程中紅細(xì)胞溶血率、負(fù)載后紅細(xì)胞的形態(tài)、變形性、滲透脆性、ATP水平等評(píng)價(jià)海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞方法的可行性。 2、測(cè)定負(fù)載海藻糖的紅細(xì)胞凍干后血紅蛋白回收率，以明確海藻糖的保護(hù)作用。篩選最佳的紅細(xì)胞凍干保護(hù)體系。研究?jī)龈杉t細(xì)胞含水量和血紅蛋白回收率之間的關(guān)系。 3、研究再水化液溫度和不同種類再水化液對(duì)凍干紅細(xì)胞血紅蛋白回收率的影響，篩選

8、最佳的再水化液溫度和最有效的再水化體系。 4、比較海藻糖、蔗糖、葡萄糖負(fù)載紅細(xì)胞的凍干保護(hù)效果，明確其凍干保護(hù)作用，為海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞技術(shù)的優(yōu)化和改進(jìn)做基礎(chǔ)。 方法： 1、用不同濃度的海藻糖外液負(fù)載紅細(xì)胞，用硫酸-蒽酮法測(cè)定各濃度組負(fù)載紅細(xì)胞的海藻糖負(fù)載率，用氰化血紅蛋白法測(cè)定負(fù)載紅細(xì)胞溶血率，選出最佳海藻糖負(fù)載液濃度。 2、在不同溫度和時(shí)間下用海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞，用硫酸-蒽酮法測(cè)定紅細(xì)胞海藻糖負(fù)載率，氰化

9、血紅蛋白法測(cè)定負(fù)載紅細(xì)胞溶血率，明確海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞的影響因素，選出最佳的負(fù)載條件。 3、從負(fù)載紅細(xì)胞的形態(tài)、負(fù)載紅細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度、細(xì)胞的溶血率、變形性、滲透脆性、紅細(xì)胞內(nèi)的ATP水平等方面，評(píng)價(jià)海藻糖負(fù)載后細(xì)胞的功能，進(jìn)一步評(píng)價(jià)此負(fù)載方法的可行性。 4、添加各種凍干保護(hù)劑，凍干負(fù)載海藻糖的紅細(xì)胞，比較各種保護(hù)劑的凍干保護(hù)效果，篩選出最佳保護(hù)體系。 5、在不同溫度下再水化凍干紅細(xì)胞，用不同的血漿增量劑再水化凍干

10、紅細(xì)胞，測(cè)定凍干紅細(xì)胞血紅蛋白回收率，選出最佳的再水化溫度和最有效的再水化體系，明確再水化機(jī)理。 6、比較經(jīng)海藻糖、蔗糖、葡萄糖負(fù)載的凍干紅細(xì)胞血紅蛋白的回收率及凍干紅細(xì)胞內(nèi)ATP水平，以明確海藻糖、蔗糖、葡萄糖對(duì)凍干紅細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果： 1、用0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、1.0M不同濃度的海藻糖負(fù)載液負(fù)載紅細(xì)胞，測(cè)定紅細(xì)胞海藻糖負(fù)載率及溶血率數(shù)據(jù)，用隨機(jī)區(qū)組方差分析方法統(tǒng)計(jì)處理，各組間均有差異，P＜0.

11、05。0.8M是最佳的海藻糖負(fù)載濃度。 2、將紅細(xì)胞負(fù)載樣品分別在4℃，15℃，23℃，37℃，41℃條件孵育3h、6h、9h、16h，測(cè)定紅細(xì)胞海藻糖負(fù)載率及溶血率數(shù)據(jù)，用重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩胤讲罘治龇椒ńy(tǒng)計(jì)處理，不同溫度之間、不同時(shí)間之間，差異均有顯著性意義P=0.000。其中37℃，6-7小時(shí)是最佳的負(fù)載條件。 3、用濃度分別為10mM、30mM、50mM、100mM的苯甲醇海藻糖負(fù)載液負(fù)載紅細(xì)胞，測(cè)定紅細(xì)胞海藻糖負(fù)載率

12、及溶血率數(shù)據(jù)，用隨機(jī)區(qū)組方差分析方法統(tǒng)計(jì)處理各組間均有差異，P＜0.05。50mM是最佳的苯甲醇負(fù)載濃度。 4、用0.8M海藻糖負(fù)載濃度，在37℃下孵育7小時(shí)后紅細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量為36.56±7.95mM。 5、經(jīng)海藻糖負(fù)載的紅細(xì)胞變形性降低，與對(duì)照組相比，P=0.000差異有顯著性意義。 6、經(jīng)海藻糖負(fù)載的紅細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低，與對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性意義。 7、經(jīng)海藻糖負(fù)載的紅細(xì)胞，細(xì)胞滲透

13、脆性降低，與對(duì)照組相比，P=0.000差異有顯著性意義。 8、海藻糖負(fù)載的紅細(xì)胞凍干，海藻糖負(fù)載組和對(duì)照組血紅蛋白回收率有差異，t=24.036，P=0.000，差異有顯著性意義。白蛋白、高濃度的PVP對(duì)凍干紅細(xì)胞有保護(hù)作用，葡聚糖對(duì)凍干紅細(xì)胞幾乎無(wú)保護(hù)作用，甘油對(duì)凍干紅細(xì)胞起破壞作用。多組保護(hù)體系相比較，羥乙基淀粉+白蛋白組保護(hù)效果最好，40％PVP+HAS+DMSO組其次。 9、選用溫度分別為4℃、15℃、25℃、3

14、7℃、41℃的再水化液再水化凍干紅細(xì)胞，溫度為4℃、15℃、25℃時(shí)，凍干紅細(xì)胞不能完全再水化。37℃、41℃的再水化液再水化凍干紅細(xì)胞，數(shù)據(jù)顯示P=0.004，差異有顯著性意義。37℃的再水化效果強(qiáng)于41℃。用臨床常用的血漿增量劑右旋糖苷、羥乙基淀粉和生理鹽水做凍干紅細(xì)胞再水化液，再水化后血紅蛋白回收率，生理鹽水組與其它各組相比較，P=0.001，差異有顯著性意義。而右旋糖苷組與羥乙基淀粉組差異無(wú)顯著性意義。同時(shí)在各種水化液中加入蔗糖

15、，蔗糖對(duì)凍干紅細(xì)胞血紅蛋白回收率影響不一致。 10、凍干紅細(xì)胞的含水量影響著凍干紅細(xì)胞血紅蛋白回收率，含水量8-10％組與3-4％組血紅蛋白回收率相比較，P=0.000，差異有顯著性意義。 11、經(jīng)海藻糖、蔗糖、葡萄糖負(fù)載紅細(xì)胞，凍干后血紅蛋白回收率數(shù)據(jù)用隨機(jī)區(qū)組方差分析統(tǒng)計(jì)方法處理，海藻糖組、蔗糖組、葡萄糖組與PBS組相比較，P=0.000差異有顯著性意義。葡萄糖組與海藻糖組、蔗糖組相比較，P=0.000，差異有顯著性

16、意義；蔗糖組和海藻糖組相比較，P=0.789，差異無(wú)顯著性意義。說(shuō)明，蔗糖和海藻糖保護(hù)效果幾乎相等。但從ATP水平數(shù)據(jù)顯示，葡萄糖組與海藻糖組、蔗糖組相比較，P=0.000，差異有顯著性意義；但蔗糖組和海藻糖組相比較，P=0.015，差異有顯著性意義。蔗糖負(fù)載的紅細(xì)胞，凍干后細(xì)胞內(nèi)ATP水平低于國(guó)際輸注標(biāo)準(zhǔn)，而海藻糖負(fù)載的紅細(xì)胞，凍干后紅細(xì)胞內(nèi)ATP水平高于國(guó)際臨床輸注標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)論： 1、海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞最適宜的濃度是0

17、.8M；37℃，6-7小時(shí)是海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞的最佳條件。苯甲醇能增強(qiáng)細(xì)胞膜流動(dòng)性，增加海藻糖負(fù)載率。50mM苯甲醇濃度是較適宜的負(fù)載濃度。 2、經(jīng)海藻糖負(fù)載的紅細(xì)胞，凍干后血紅蛋白回收率明顯提高，且生理功能正常，符合輸注標(biāo)準(zhǔn)。海藻糖、人血白蛋白、聚乙烯吡個(gè)咯烷酮對(duì)凍干紅細(xì)胞均有保護(hù)作用。低濃度的葡聚糖對(duì)凍干紅細(xì)胞幾乎無(wú)保護(hù)作用，甘油對(duì)凍干紅細(xì)胞起破壞作用。 3、37℃是凍干紅細(xì)胞再水化的適宜溫度，臨床上應(yīng)用的右旋糖苷及羥