紅細(xì)胞凍干保存影響因素的初步研究.pdf

1、紅細(xì)胞長(zhǎng)期保存是輸血醫(yī)學(xué)中的重要研究課題，凍干法是實(shí)現(xiàn)紅細(xì)胞長(zhǎng)期保存的方法之一。早在上世紀(jì)60年代，就有學(xué)者嘗試以凍干的方式保存紅細(xì)胞。至上世紀(jì)90年代，紅細(xì)胞的凍干保存成為低溫生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外的數(shù)個(gè)研究小組對(duì)凍干保護(hù)劑的篩選和凍干、復(fù)水過程等環(huán)節(jié)進(jìn)行了大量的研究。在此過程中，發(fā)現(xiàn)凍干的紅細(xì)胞總有一部分水難以去除，將這部分水定義為“殘余水分”。殘余水相關(guān)問題是目前紅細(xì)胞凍干保存研究遇到的爭(zhēng)議和瓶頸之一。近年來，發(fā)現(xiàn)甘油作為滲透

2、性保護(hù)劑，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)形成氫鍵，降低了電解質(zhì)的濃度，減少了胞內(nèi)冰的形成，與PVP等非滲透性的保護(hù)劑聯(lián)合使用，保護(hù)效果較好。但是甘油有保濕護(hù)水作用，不利于干燥，這與去除水分又相矛盾，可見對(duì)于保護(hù)劑中甘油與殘余水的問題還有很多工作去做。
　　本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上對(duì)紅細(xì)胞凍干保護(hù)劑中甘油濃度及與殘余水的關(guān)系、凍干紅細(xì)胞殘余水含量測(cè)定方法等問題進(jìn)行了初步研究。
　　目的:本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)保護(hù)

3、劑中甘油濃度、凍干程序（擱板溫度、干燥時(shí)間）及保存時(shí)間與細(xì)胞回收率、溶血率、殘余水含量的關(guān)系進(jìn)行了研究;同時(shí)，對(duì)凍干紅細(xì)胞回收率、殘余水含量測(cè)定等技術(shù)方法進(jìn)行了對(duì)比分析，為進(jìn)一步探討紅細(xì)胞凍干殘余水對(duì)紅細(xì)胞凍干保存的影響提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:用不同甘油濃度保護(hù)劑處理紅細(xì)胞，設(shè)置不同擱板溫度及次級(jí)干燥時(shí)間，用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用計(jì)數(shù)板、全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)紅細(xì)胞，氰化高鐵法測(cè)定血紅蛋白，分析細(xì)胞復(fù)水、洗脫保護(hù)劑恢

4、復(fù)等滲后細(xì)胞回收率、溶血率情況。用熱重法、Karl-Fischer化學(xué)法及其改進(jìn)方法測(cè)定凍干紅細(xì)胞水含量，對(duì)比不同方法的結(jié)果，分析不同保護(hù)劑組的凍干紅細(xì)胞剩余水含量變化情況。
　　結(jié)果:1、本研究所用保護(hù)劑中不同甘油濃度(3％，6％，9％，12％，15％，18％，21％)(w/v)對(duì)紅細(xì)胞凍干保存的影響:各組凍干復(fù)水后的紅細(xì)胞形態(tài)正常，凍干紅細(xì)胞殘余含水量為(11.53±0.33)％～（35.32±1.53）％，細(xì)胞回收率為(51

5、.04±6.14)％～（84.37±8.62）％，細(xì)胞溶血率為（15.86±2.23）％～(43.43±6.51)％。殘余含水量隨甘油濃度的增大而升高，具有很好的相關(guān)性，R2=0.9963;9％，12％，15％三組細(xì)胞復(fù)水回收率、溶血率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.076)，細(xì)胞凍干保存效果較好與其余各組之間差異有顯著性(P＜0.01)。
　　2、不同擱板溫度-60℃，-50℃，-40℃，-30℃組，洗脫保護(hù)劑后細(xì)胞回收率分別為58.

6、50±7.29，22.67±2.10，21.52±1.70，29.73±1.35，細(xì)胞溶血率分別為77.55±3.26，82.31±1.16，85.30±1.35，84.37±0.62，殘余水含量分別為25.18±0.19，22.12±1.46，23.02±1.25，26.19±0.58。當(dāng)擱板溫度為-60℃、次級(jí)干燥時(shí)間為2h時(shí)，紅細(xì)胞凍干保存效果最優(yōu)，洗脫保護(hù)劑后細(xì)胞回收率、溶血率與其余各組比較差異有顯著性(P＜0.01)。不延長(zhǎng)次

7、級(jí)干燥時(shí)間組(次級(jí)干燥2h)，紅細(xì)胞凍干保存效果優(yōu)于延長(zhǎng)次級(jí)干燥時(shí)間組(次級(jí)干燥2h后再延長(zhǎng)24h)，差異有顯著性(P＜0.01)，兩組凍干紅細(xì)胞殘余水含量差異無顯著性，P=0.273。紅細(xì)胞凍干后隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞回收率呈下降趨勢(shì)，不同保存時(shí)間段溶血率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3、凍干紅細(xì)胞洗脫保護(hù)劑恢復(fù)等滲后計(jì)數(shù)，儀器計(jì)數(shù)結(jié)果為（2.29±0.08）×1012，手工計(jì)數(shù)結(jié)果為（0.71±0.11）×1012，差異

8、有顯著性(P＜0.01)。Karl-Fischer法、Karl-Fischer聯(lián)合卡式爐法、Karl-Fischer法聯(lián)合質(zhì)量差法及熱重法，測(cè)定凍干紅細(xì)胞剩余水含量百分比分別為（3.20±0.52）％，(6.70±1.22)％，(10.07±0.19)％，(25.18±0.42)％，結(jié)果有顯著性差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)所用紅細(xì)胞凍干保存保護(hù)劑配方最適甘油濃度為(9～15)％(w/v)，最適擱板溫度為

9、-60℃，次級(jí)干燥時(shí)間為2h;
　　3.甘油濃度與殘余含水量具有線性相關(guān)性，可以采用不同甘油濃度來控制殘余水含量;
　　3.熱重法較Karl-Fischer法、KF聯(lián)合質(zhì)量差法及KF聯(lián)合卡式爐法——檢測(cè)殘余含水量結(jié)果偏高;KF聯(lián)合卡式爐法能有效避免樣本溶解不完全問題，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性高于單純的Karl-Fischer法;
　　4.當(dāng)紅細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，應(yīng)用計(jì)數(shù)板法測(cè)定凍干紅細(xì)胞回收率，可有效避免損傷細(xì)胞對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性造成