凍干紅細(xì)胞殘余水含量的測(cè)量、分布及其代謝影響研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)研究基于課題組先前的基礎(chǔ)，探索凍干紅細(xì)胞殘余水分的最佳測(cè)定方法，探索凍干條件如溫度、干燥時(shí)間對(duì)紅細(xì)胞殘余水含量的影響，同時(shí)研究了殘余水的分布和其紅細(xì)胞代謝的影響，為進(jìn)一步深入探索殘余水在紅細(xì)胞冷凍干燥保存方面的影響提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　對(duì)同一程序凍干的紅細(xì)胞分別使用Karl-Fisher萃取法結(jié)合滴定法（Karl-Fisher法）、熱重分析法、核磁共振法測(cè)定凍干紅細(xì)胞殘余水，分析各組間

2、結(jié)果差異；使用同一程序同時(shí)凍干等量的含保護(hù)劑的血影細(xì)胞、含保護(hù)劑的紅細(xì)胞、無(wú)保護(hù)劑的血影細(xì)胞、無(wú)保護(hù)劑的紅細(xì)胞，分別測(cè)定其殘余水含量并進(jìn)行對(duì)比分析；控制凍干條件（時(shí)間、溫度、真空度）制備不同殘余水含量的凍干紅細(xì)胞，用Karl-Fisher法測(cè)定其殘余水含量，室溫放置保存，分別在凍干之前，凍干完成時(shí)、完成1個(gè)月后、完成3個(gè)月后、完成6個(gè)月后測(cè)定其ATP活性、SOD活力，分析不同殘余水含量組之間代謝數(shù)據(jù)的變化和關(guān)聯(lián)情況。
　　結(jié)果：<

3、br>　　本研究使用含12%甘油濃度（w/v）的保護(hù)劑，使用三種不同方法測(cè)定凍干紅細(xì)胞、凍干血影細(xì)胞、及水分標(biāo)準(zhǔn)品的殘余水含量。Karl-Fisher法測(cè)得凍干紅細(xì)胞水分含量為（3.37±0.05）%，無(wú)保護(hù)劑凍干紅細(xì)胞水分含量為（1.22±0.09）%，水分標(biāo)準(zhǔn)品水分含量為（5.14±0.13）%；熱重分析法測(cè)得凍干品水分含量為（12.40±0.56）%，無(wú)保護(hù)劑凍干品水分含量為（4.60±0.78）%，水分標(biāo)準(zhǔn)品水分含量為（5.28

4、±0.16）%；核磁共振法測(cè)得凍干品水分含量為（0.78±0.09）%，無(wú)保護(hù)劑凍干品水分含量為（0.89±0.12）%，水分標(biāo)準(zhǔn)品水分含量為（4.99±0.18）%。除水分標(biāo)準(zhǔn)品外，三組間比較結(jié)果差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。使用方差分析多樣本間 LSD檢驗(yàn)，凍干血影細(xì)胞組和凍干紅細(xì)胞組比較均為 P＞0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血影細(xì)胞和紅細(xì)胞的殘余水分量無(wú)差異。Karl-Fisher法能夠很好地反應(yīng)含保護(hù)劑及不含保護(hù)劑凍干紅細(xì)

5、胞的殘余水分含量，熱重分析法適用于無(wú)甘油保護(hù)劑的凍干紅細(xì)胞水分測(cè)定，核磁共振法測(cè)定值過(guò)低。
　　通過(guò)控制凍干條件制備殘余水含量不同的六組凍干紅細(xì)胞，由低到高分別為2.80%，5.12%，9.10%，10.77%，11.73%，12.45%。凍干后完成一周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月后復(fù)水、洗滌，測(cè)得ATP含量和SOD活性，同時(shí)與凍干前紅細(xì)胞的測(cè)定值進(jìn)行比較。各組間 ATP值和 SOD活力均隨時(shí)間有所下降，殘余水含量在2.80%和5.1

6、2%的兩組樣本功能隨著時(shí)間下降趨勢(shì)開始逐漸平緩。
　　結(jié)論：
　　對(duì)于含甘油保護(hù)劑的凍干紅細(xì)胞，Karl-Fisher法、熱重法和核磁共振法均可以測(cè)定其殘余水含量，測(cè)定絕對(duì)值之間存在顯著差異。熱重分析法測(cè)得結(jié)果偏高，核磁共振法測(cè)得結(jié)果偏低；
　　凍干紅細(xì)胞殘余水與凍干血影細(xì)胞殘余水含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示凍干紅細(xì)胞殘余水分布于紅細(xì)胞膜上；
　　不同殘余水含量組凍干紅細(xì)胞的ATP含量和SOD活性水平隨著保存時(shí)間的