氟伐他汀對組織因子表達與RhoA-Rho激酶通路的影響及機制研究.pdf

1、背景:組織因子(TF)與動脈粥樣硬化血栓形成之間的關(guān)系十分密切，他汀類藥物被證實具有抗炎、抗氧化及防止血栓形成等獨立于降脂以外的多效性，甲羥戊酸(MVA)是膽固醇合成的中間代謝產(chǎn)物，他汀類藥物是在競爭抑制膽固醇合成限速酶同時，間接抑制MVA途徑中的類異戊二烯等中間產(chǎn)物的合成，而這些中間產(chǎn)物是細胞信號轉(zhuǎn)導及細胞間復雜聯(lián)系的重要介質(zhì)，也是Rho等小G蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾過程中重要的脂質(zhì)附著分子。他汀類藥物對TF表達的影響如何?TF是否經(jīng)RhoA信

2、號轉(zhuǎn)導通路激活后促進其表達?而他汀類對TF表達的影響是否受RhoA信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控?上述問題均不清楚。研究首先從臨床角度證實血漿TF水平對于急性心肌梗死(AMI)患者判斷近期臨床不良預后的重要意義，然后從TF活性、基因以及蛋白水平觀察不同濃度的氟伐他汀(Flu)對由腫瘤壞死因子-a(TNF-a)誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)TF表達與RhoA活化的抑制作用，并從蛋白水平探討其可能的RhoA/Rho激酶通路的調(diào)控機制。

3、目的: 1.研究AMI患者血漿TF水平與C反應(yīng)蛋白(CRP)、心肌酶(CK-MB)、心功能(LVEF)及相關(guān)臨床事件等指標之間的關(guān)系，探討血漿TF水平在預測AMI患者臨床不良預后方面的意義； 2.研究不同濃度Flu對由TNF-a誘導的HUVECs TF含量、活性及TFmRNA表達、TF蛋白水平的影響，探討他汀類藥物在抗血栓形成方面的作用； 3.研究RhoA/Rho激酶在氟伐他汀影響TF蛋白表達過程中的調(diào)控作用，探

4、討氟伐他汀在抗動脈粥樣硬化血栓形成作用的新靶點。 方法: 1.采用ELISA方法檢測AMI患者、穩(wěn)定型心絞痛(SAP)患者以及健康人血漿TF水平，依據(jù)血漿TF水平將AMI患者分為高TF組與低TF組，同時測定CRP、CK-MB、LVEF等指標，隨訪30天，記錄主要心血管事件(心臟性猝死、充血性心力衰竭、非致命性再梗等)的發(fā)生率，以TF為自變量，對CRP、CK-MB、LVEF與主要心血管事件等指標進行相關(guān)分析； 2.

5、將同一簇人臍靜脈內(nèi)皮細胞株進行培養(yǎng)、傳代后，分設(shè)對照組、TNF-a組、Flu組及干預組(TNF-a+Flu組)，其中TNF-a+Flu組中分別以不同濃度氟伐他汀(0.01，0.1，1，10，100μmol/L)干預，采用ELISA方法測定TF含量，用發(fā)色底物法測定TF活性，用RT-PCR方法測定TFmRNA表達水平，用Western-Blot方法測定TF蛋白表達和RhoA的活化水平；對照組、WNF-a+AngⅡ組、AngⅡ組、TNF-a

6、組、FNF-a+Y27632組五組HUVECs，采用Western-Blot方法測定TF蛋白表達水平； 3.以SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)+標準差(X±S)表示。對主要統(tǒng)計指標均進行正態(tài)性分布檢驗，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗。以上檢驗均以P<0.05為顯著性統(tǒng)計學意義。 結(jié)果: 1.SAP和AMI組患者TF水平較健康人明顯升高[(28.34±17.58)pg/ml vs(16.73±8.2

7、8)pg/ml；(42.76±25.14)pg/ml vs(16.73±8.28)pg/ml]，與SAP比較，AMI組患者TF水平亦明顯升高[(42.76±25.14)pg/ml vs(28.34±17.58)pg/ml]；在AMI患者中，高TF組主要心血管事件顯著高于低TF組(48.4％vs19.4％)，Logistic回歸分析表明，血漿TF水平與AMI患者心血管事件的發(fā)生呈正相關(guān)(OR為1.45)；與低TF組比較，高TF組患者CRP

8、[(12.7±5.9)mg/lvs(9.3±4.9)mg/l]、CK-MB[(84.4±30.2)U/Lvs(65.9±29.7)U/L]顯著升高，LVEF顯著降低[(34.9±11.4)％vs(51.9±8.9)％]，多元線性回歸分析顯示，TF與CRP(r=0.702)、CK-MB(r=0.519)呈正相關(guān)，與LVEF(r=-0.312)呈負相關(guān)； 2.TNF-a組TF含量[(9.64±0.58)pg/mlvs(2.30±0.

9、20)pg/ml]及TF活性[(32.56±3.12)pMvs(11.36±0.67)pM]、TFmRNA表達[(0.88±0.26)vs(0.02±0.01)]與TF蛋白水平[(0.94±0.32)vs(0.06±0.02)]較空白組均顯著增高；與TNF-a組比較，不同濃度氟伐他汀干預組TF含量與活性以及TFmRNA表達和TF蛋白水平均明顯降低，差異有顯著性；Flu的抑制作用呈濃度依賴性，F(xiàn)lu在濃度1μmol/L時可顯著抑制由TNF

10、-a誘導的TF水平及活性[(4.99±0.24)pg/mlvs(9.64±0.58)pg/ml，(20.27±1.26)pg/mlvs(32.56±3.12)pM]，繼續(xù)升高Flu濃度，作用無顯著差異。 3.TNF-a在誘導HUVECsTF表達的同時，可使RhoA活化，氟伐他汀可抑制RhoA活化；AngⅡ(RhoA激酶激動劑)可促進TNF-a誘導的HUVECsTF蛋白表達水平，而Y27632(RhoA激酶抑制劑)可抑制TNF-a

11、誘導的HUVECsTF蛋白表達水平。 結(jié)論: 1.TF是參與動脈粥樣硬化破裂斑塊血栓形成的關(guān)鍵因素，血漿TF水平的變化與AMI患者炎癥、病變范圍與嚴重程度呈正相關(guān)，早期測定血漿TF可以作為AMI患者判斷未來心血管事件等不良預后的一個可行的預測因子； 2.氟伐他汀可有效抑制由TNF-a誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞TF含量、活性和基因以及蛋白表達水平，提示氟伐他汀具有潛在的降脂之外的抗動脈血栓作用； 3.氟伐他汀對