大鼠胚胎期及出生早期乳腺發(fā)育和乳腺干細(xì)胞的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物的乳腺是一個(gè)很特殊的器官，雌性動(dòng)物的乳腺可以在重復(fù)的懷孕和生產(chǎn)的多次循環(huán)中再生、退化，是動(dòng)物出生后唯一可以多次重復(fù)再生的器官。早在1959年，DeOme等人研究證實(shí)，乳腺組織塊移植到去除乳腺腺上皮的小鼠乳腺脂肪墊中可以再生小鼠乳腺。1967年Horishino等人進(jìn)行的系列移植研究表明，乳腺上皮細(xì)胞具有自我復(fù)制的能力，且可以維持到第七次移植。1998年Kordon等人通過對(duì)嚙齒類動(dòng)物乳腺的研究，發(fā)現(xiàn)乳腺中存在至少一種以上多能干/

2、祖細(xì)胞。由于再生乳腺與乳腺腫瘤的關(guān)系以及乳腺自身發(fā)育的特殊性，乳腺是研究器官發(fā)生、細(xì)胞分化、器官修復(fù)再生等機(jī)理的合適的模型。1999年，Chepko和Smith證實(shí)了乳腺中存在一個(gè)類乳腺干細(xì)胞祖系(lineage)，正是這些乳腺干細(xì)胞保證了哺乳動(dòng)物乳腺在多次的懷孕生產(chǎn)過程中乳腺再生、泌乳和退化的周期的維持。不同發(fā)育時(shí)期的動(dòng)物乳腺中都存在一定比例的干細(xì)胞，正是這些干細(xì)胞維持和保證了乳腺發(fā)育的特征。 因此，研究大鼠胚胎期和出生早期乳

3、腺的各個(gè)發(fā)育階段的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、各種細(xì)胞成分的組成和分布規(guī)律，以及乳腺干細(xì)胞在各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)將幫助我們更深入地了解乳腺的發(fā)生、發(fā)育以及乳腺干細(xì)胞的生物學(xué)特性，并有助于了解乳腺干細(xì)胞與乳腺發(fā)育、再生、癌變之間的關(guān)系。 我們以大鼠為模型，運(yùn)用組織學(xué)、免疫組織化學(xué)的手段，研究了大鼠胚胎期和出生早期的乳腺發(fā)育規(guī)律，以及周圍組織的發(fā)生演變；大鼠乳腺組織發(fā)育過程中乳腺干細(xì)胞的分布、形態(tài)和標(biāo)記。 一、胚胎期及出生早期的大鼠乳腺發(fā)育的形態(tài)

4、學(xué) 選取妊娠第14天、17天、20天胚胎及出生后3天、8天、16天的幼鼠，采用Bouin固定液固定，梯度乙醇脫水，胚胎期使用甲苯透明，出生后使用二甲苯透明，石蠟包埋，5μm厚度連續(xù)切片。采用HE染色的方法研究大鼠胚胎期和出生早期乳腺的形態(tài)學(xué)變化。 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示： 14日齡鼠胚在胸壁兩側(cè)出現(xiàn)兩個(gè)高起的乳腺嵴，由外胚層局部增厚所成。外胚層的乳腺嵴向深部延伸，形成上皮細(xì)胞團(tuán)，即乳腺原基—乳腺芽。周圍的間充質(zhì)細(xì)胞環(huán)

5、繞乳腺芽成同心圓排列形成厚厚一層乳腺間充質(zhì)。 17日齡的鼠胚，乳腺芽的上皮細(xì)胞增殖形成一個(gè)細(xì)胞索，伸入其下方的間充質(zhì)，往下延伸形成初級(jí)導(dǎo)管，管壁的上皮細(xì)胞中出現(xiàn)有絲分裂。導(dǎo)管末端的管腔內(nèi)有實(shí)心的細(xì)胞團(tuán)。初級(jí)導(dǎo)管管壁上皮內(nèi)可見少量的小亮細(xì)胞，其體積較小，呈圓形，細(xì)胞質(zhì)染色比較淺亮。周圍的結(jié)締組織中可以看到未分化的間充質(zhì)細(xì)胞和微血管、幼稚的成纖維細(xì)胞、成熟的成纖維細(xì)胞和一些嗜堿性顆粒細(xì)胞。 20日齡的鼠胚，初級(jí)導(dǎo)管形成中空的

6、次級(jí)導(dǎo)管，導(dǎo)管出現(xiàn)分支，分布在乳脂墊前體內(nèi)。次級(jí)導(dǎo)管上皮細(xì)胞內(nèi)可見有絲分裂，零星分布著一些小亮細(xì)胞和大亮細(xì)胞。管壁的外周包圍著一薄層的結(jié)締組織。乳脂墊前體形成，次級(jí)導(dǎo)管及其分支進(jìn)入乳脂墊前體。乳脂墊前體主要由前脂肪細(xì)胞組成，其間還可見橢圓形的嗜酸性細(xì)胞、梭形的成纖維細(xì)胞，以及微血管。 出生后3天的幼鼠，腺體增大，次級(jí)導(dǎo)管上皮細(xì)胞增多，形成雙層。導(dǎo)管末端細(xì)胞多層，緊密排列，可見很少量的體積較小的小亮細(xì)胞。導(dǎo)管周圍的脂肪組織逐漸成熟

7、，發(fā)育成為乳脂墊。脂肪組織內(nèi)主要由脂肪細(xì)胞組成，還可見成纖維細(xì)胞，小血管斷面，嗜酸性細(xì)胞。 出生后8天的幼鼠，乳脂墊內(nèi)可見次級(jí)導(dǎo)管的斷面。導(dǎo)管上皮細(xì)胞中可見不同時(shí)期的有絲分裂，細(xì)胞分裂比較旺盛。可見少量的體積較小的小亮細(xì)胞。 導(dǎo)管周圍的脂肪組織進(jìn)一步成熟，脂肪組織內(nèi)可見成纖維細(xì)胞，血管斷面，嗜酸性細(xì)胞。 出生后16天的幼鼠，次級(jí)導(dǎo)管上皮細(xì)胞中間可見少量的體積較小的圓形的小亮細(xì)胞。小亮細(xì)胞多位于導(dǎo)管基底部。導(dǎo)管周圍

8、的脂肪組織，已經(jīng)發(fā)育成熟，脂肪組織內(nèi)可見成纖維細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞，血管、神經(jīng)的斷面。 以上結(jié)果表明：胚胎期乳腺發(fā)育有三個(gè)主要的特征：1)妊娠第14天，外胚層的乳腺嵴向深部延伸，形成乳腺芽；妊娠第17天，形成實(shí)心的初級(jí)導(dǎo)管；妊娠第20天，初級(jí)導(dǎo)管形成中空的次級(jí)導(dǎo)管，并出現(xiàn)分支。2)妊娠17天發(fā)現(xiàn)初級(jí)導(dǎo)管上皮中有小亮細(xì)胞出現(xiàn)；妊娠20天在次級(jí)導(dǎo)管上皮中出現(xiàn)小亮細(xì)胞和大亮細(xì)胞。3)妊娠第14天，乳腺間充質(zhì)包裹在乳腺芽周圍；妊娠第17天，

9、乳腺間充質(zhì)已分化為結(jié)締組織；妊娠第20天，乳脂墊前體形成。出生后早期次級(jí)導(dǎo)管發(fā)育緩慢，無明顯變化；出生后3天，乳脂墊前體發(fā)育為乳脂墊。 二、免疫組織化學(xué)方法鑒定乳腺干細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞 選取妊娠20天胚胎及出生后3天、8天的幼鼠，Bouin固定液固定，石蠟包埋與切片。采用免疫酶組織化學(xué)和免疫熒光組織化學(xué)方法，以Sca-1和CK18為標(biāo)記蛋白，分別鑒定乳腺干細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞。 免疫酶組織化學(xué)觀察結(jié)果顯示，妊娠第2

10、0天的鼠胚，在次級(jí)導(dǎo)管基底部出現(xiàn)Sca-1陽性細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目很少，零星分布。在次級(jí)導(dǎo)管靠近管腔處出現(xiàn)CK18陽性細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目也很少。出生后3天和8天的乳鼠，在次級(jí)導(dǎo)管基底部的Sca-1陽性細(xì)胞呈強(qiáng)陽性染色，細(xì)胞數(shù)目很少，零星分布。CK18陽性細(xì)胞數(shù)目仍很少，但呈緩慢增長趨勢(shì)，主要分布在靠近管腔處。Sca-1陽性細(xì)胞為乳腺干細(xì)胞；根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)大小和分布位置，確定Sca-1陽性細(xì)胞是小亮細(xì)胞。CK18陽性細(xì)胞為已分化的腺上皮細(xì)胞。