惡性腫瘤基因工程納米疫苗的研制及其藥代動(dòng)力學(xué)初步研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重地威脅著人類的健康，已成為人類主要死因之一。手術(shù)、化療和放療是治療惡性腫瘤的三大傳統(tǒng)療法，其治療效果并非盡如人意。隨著免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，腫瘤疫苗的研制與應(yīng)用已成為治療腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的有力手段。但是，現(xiàn)有腫瘤疫苗由于缺乏有效的抗原提呈，以及MHC 限制性、腫瘤異質(zhì)性、疫苗生物利用度差等問(wèn)題，在走向臨床運(yùn)用的過(guò)程中還面臨很多困難。黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE（Melanoma associate antige

2、n）屬于腫瘤/睪丸抗原，其中MAGE1、MAGE3是腫瘤免疫治療的理想靶分子，在多種腫瘤組織中表達(dá)而不在正常組織表達(dá)（除睪丸和胎盤），被稱為腫瘤特異性共有抗原。熱休克蛋白是一種抗原遞呈的輔助分子，可以增強(qiáng)腫瘤的免疫原性。在以往本室的研究中已證實(shí)MAGE1、MAGE3 與HSP70 的融合蛋白可以增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體針對(duì)MAGE1 和/或MAGE3的免疫反應(yīng)，是一種優(yōu)良的抗原物質(zhì)，并構(gòu)建了“惡性腫瘤基因工程納米疫苗”。為了進(jìn)一步提高該疫苗的抗腫瘤

3、免疫活性，提高疫苗的生物利用度，也為了將該疫苗推向臨床前研究，逐步進(jìn)入成果的轉(zhuǎn)化開(kāi)發(fā)，本研究以腫瘤特異性抗原MAGE1、MAGE3 與熱休克蛋白HSP70 融合蛋白等前期研究工作為基礎(chǔ)，采用周期短、產(chǎn)率高且穩(wěn)定可靠的中試發(fā)酵工藝，生產(chǎn)了足夠后期臨床前研究所用的重組蛋白，并對(duì)其進(jìn)行酯化，再以納米長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體作為載體，制備惡性腫瘤基因工程納米脂質(zhì)體疫苗，而后研究該疫苗對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的作用，以及該疫苗在小鼠體內(nèi)的吸收、分布、轉(zhuǎn)化和排

4、泄等過(guò)程的速度規(guī)律。 1. 鑒定重組工程菌pET28a-MAGE1/HSP70/MAGE3(MHM)/BL21(DE3)并檢測(cè)其生物學(xué)性狀的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示含有該表達(dá)載體的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后以包涵體形式表達(dá)重組蛋白，新生的蛋白條帶能夠和抗MAGE1 單抗和抗MAGE3 多抗特異性結(jié)合；對(duì)重組工程菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，菌體經(jīng)裂菌、包涵體的洗滌、溶解變性和透析復(fù)性，最后經(jīng)親和層析柱純化獲得純度＞80％的重組蛋白；該重組工程菌菌株連續(xù)

5、傳至50 代后，進(jìn)行質(zhì)粒性狀、掃描電鏡觀察、融合蛋白表達(dá)水平、細(xì)菌染色及各項(xiàng)生化反應(yīng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌株呈現(xiàn)典型的大腸桿菌形態(tài)，生物學(xué)形狀穩(wěn)定，可作為生產(chǎn)用菌種。 2. 為滿足臨床前各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的需要，將工程菌發(fā)酵和蛋白純化工藝放大至中試規(guī)模。采用溶氧反饋-分批補(bǔ)料培養(yǎng)方式，對(duì)影響工程菌生長(zhǎng)及目的蛋白表達(dá)的因素如發(fā)酵培養(yǎng)基、活化時(shí)間、誘導(dǎo)濃度及時(shí)間、pH 值及分批補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等條件進(jìn)行優(yōu)化，在20L 發(fā)酵罐中連續(xù)進(jìn)行了三批工程菌發(fā)酵，

6、工程菌生長(zhǎng)正常，目的蛋白MHM 和M3H 的表達(dá)量均大于35％，保證了工程菌的穩(wěn)定性；對(duì)實(shí)驗(yàn)室摸索的蛋白純化工藝進(jìn)行改進(jìn)，連續(xù)純化了三批M3H融合蛋白，純度均在90％以上，生產(chǎn)規(guī)模達(dá)到中試要求；通過(guò)對(duì)融合蛋白的理化性質(zhì)、純度、生物學(xué)活性和殘留雜質(zhì)等幾方面的控制，確認(rèn)目的蛋白符合基因工程藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。 3. 為有效提高脂質(zhì)體包裹大分子蛋白的包封率，提高腫瘤抗原的生物利用度，運(yùn)用化學(xué)合成方法將腫瘤特異性抗原融合蛋白與硬脂酸交

7、聯(lián)，使融合蛋白酯化后再進(jìn)行納米包裹，成功制備出平均粒徑為87.9nm（CV=0.371）的衍生腫瘤抗原納米脂質(zhì)體疫苗，其藥物包封率達(dá)到86％，顯著高于單純腫瘤抗原納米脂質(zhì)體（37％），有效增強(qiáng)了抗原的生物利用率。該疫苗于4℃放置6 月后無(wú)沉淀及分層，具備優(yōu)良的理化性質(zhì)。通過(guò)IFN-γ ELISPOT 和LDH 釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)疫苗激活小鼠特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的情況，發(fā)現(xiàn)該疫苗比游離蛋白疫苗能更好的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)MAGE3 的特異性CTL，對(duì)

8、表達(dá)MAGE3的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用。間接ELISA 結(jié)果顯示，該疫苗能夠提高機(jī)體MAGE3 的抗體水平，有效激活小鼠的體液免疫反應(yīng)。 4. 在小鼠體內(nèi)對(duì)該疫苗進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)研究，首先制備125I 標(biāo)記的衍生融合蛋白（125I-SA-MH）和125I 標(biāo)記的衍生融合蛋白脂質(zhì)體（125I-L-SA-MH），小鼠單次給藥后，三氯醋酸（TCA）沉淀法測(cè)定血漿、組織、尿和糞的放射性含量，3p97 軟件擬合藥物動(dòng)力學(xué)模型，并計(jì)算

9、相應(yīng)參數(shù)。結(jié)果顯示，125I-SA-MH和125I-L-SA-MH單次靜脈注射后在小鼠體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程符合兩室模型。在相同劑量條件下，125I-L-SA-MH分布相半衰期T1/2α和消除相半衰期T1/2β和AUC均有所增加；125I-SA-MH的總體清除率比125I-L-SA-MH大，證明脂質(zhì)體包裹能保護(hù)藥物，有一定的緩釋作用，可進(jìn)一步提高藥物的生物利用度。體內(nèi)分布試驗(yàn)結(jié)果表明，125I-SA-MH 進(jìn)入血液后首先迅速聚集到肝臟，而12