喜樹堿對結(jié)腸癌細(xì)胞系誘導(dǎo)性一氧化氮合酶合成的影響.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文喜樹堿對結(jié)腸癌細(xì)胞系誘導(dǎo)性一氧化氮合酶合成的影響姓名：沈香娣申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：陳增良20060501浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文將生長至對數(shù)生長期的Sw鋁O細(xì)胞經(jīng)胰蛋自酶消化后，以約20l釅個(gè)，孔接弛于96孔培養(yǎng)板中，放入37℃、5％c02的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)，細(xì)胞貼壁后小心棄去舊培養(yǎng)基，每孔加200此含10％新生小牛血清(BCs)、lO肛g，I，的脂多糖(LPs)、20ng，L的自介素

2、lp(IL—ip)的DMEM培養(yǎng)基，加入不同終濃度的喜樹堿溶液分別作用與上述細(xì)胞。②測定iNOsInI礬A和蛋白生成量的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞準(zhǔn)備將生長至對數(shù)生長期的sw480細(xì)胞消化后以2106，瓶的細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)，放入37℃、5％C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12，J、時(shí)，纓胞貼壁后小心棄去f匿培養(yǎng)基，每瓶加lOmL含10％BCS、10州L的LPS、20119／L的ILlp的DMEM培養(yǎng)基，將終濃度為O125p咖nL、O25“咖L的喜樹堿加入上述準(zhǔn)備的細(xì)胞作

3、用24小時(shí)。2喜樹堿對SW480細(xì)脆N0生成量的影響(1)取50、100、150、200#moUL的N烈02各100虬，加GrieSS試劑，青4得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)方程。(2)按前述準(zhǔn)備的細(xì)胞分剮培養(yǎng)18小時(shí)、24小時(shí)，用Griess法測NO的生成量，同時(shí)用Mrr法測細(xì)胞的存活率。3喜樹堿對S、張80細(xì)胞iNOsmRNA表達(dá)的影響按1Hzlo試劑盒說明一步法提取Sw480細(xì)胞的總RNA，用紫外線分光光度計(jì)測定RNA的純度并定量。取總RN

4、A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然盾再進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在15％瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用凝膠掃攢儀對電泳帶進(jìn)行吸光度掃描，并以GAPDH校正做相對量分析，數(shù)值以兩者積分吸光度的比值表示。4喜樹堿對Sw480細(xì)脆iNOS蛋白質(zhì)表達(dá)的影晌將實(shí)驗(yàn)sw480細(xì)胞消化離心后加蛋白裂解液提取總蛋白，測定蛋白濃度，上樣，電泳，然后轉(zhuǎn)移樣品至硝酸纖維素膜上。封閉，加一抗、二抗雜交，用HRP—ECL發(fā)光法檢測，見淡綠色熒光條帶，將膜固定予膠片盒中，曝光后顯影，定影。應(yīng)