以轉(zhuǎn)基因?yàn)榛A(chǔ)的胰島生物發(fā)光影像學(xué)和胰島素合成功能研究.pdf

1、臨床胰島移植最近幾年的突破性進(jìn)展，為糖尿病的治愈帶來了希望，其相關(guān)的臨床和基礎(chǔ)研究也進(jìn)展較快，其中利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)胰島功能進(jìn)行改造，從而促進(jìn)胰島移植的臨床應(yīng)用是一個(gè)重要方向。本論文即針對(duì)以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為基礎(chǔ)的胰島生物發(fā)光顯像技術(shù)(BLI)，和胰島被轉(zhuǎn)入外源性胰島素基因后的合成功能特性，作了一定程度的探討。BLI可實(shí)現(xiàn)對(duì)植入胰島的在體監(jiān)測(cè)，為臨床治療和相關(guān)研究提供及時(shí)、直接、準(zhǔn)確的信息。而將外源性胰島素基因轉(zhuǎn)入胰島細(xì)胞，可提高其胰島素合成釋

2、放功能，用更少量的胰島即可達(dá)到治療目的，從而節(jié)約供體，在一定程度上緩解供體緊缺的矛盾。此兩項(xiàng)技術(shù)均可能對(duì)促進(jìn)胰島移植的廣泛臨床應(yīng)用起重要作用。
　　 第一部分、生物發(fā)光顯像技術(shù)對(duì)胰島移植后植入胰島監(jiān)測(cè)作用研究
　　 目的：目前的臨床胰島移植對(duì)植入受體后的胰島缺乏安全有效的監(jiān)測(cè)手段，是一個(gè)亟待解決的重要問題，本研究通過小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討用BLI監(jiān)測(cè)植入胰島存活狀態(tài)的優(yōu)勢(shì)，并針對(duì)該方法臨床應(yīng)用的主要障礙——光信號(hào)因經(jīng)過厚層組

3、織而發(fā)生衰減，無法成像——提出可行的解決方法，即用移植于皮下脂肪內(nèi)的生物發(fā)光胰島，作為深部器官內(nèi)植入胰島的標(biāo)志，從而證明將BLI用于臨床的可行性。
　　 方法：自腦死亡器官捐獻(xiàn)者胰腺、及正常B6小鼠、Bclb/c小鼠胰腺分離胰島，將熒光素酶基因轉(zhuǎn)入胰島(生物發(fā)光胰島)，并制作小鼠糖尿病模型，將生物發(fā)光胰島植入糖尿病小鼠，分別制作皮下脂肪內(nèi)胰島移植模型和皮下及腎包膜下同時(shí)移植模型。通過選擇不同供受體搭配，將模型分為無免疫排斥組和有

4、免疫排斥組。對(duì)皮下移植模型，在各設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)用生物發(fā)光顯像裝置對(duì)受體小鼠進(jìn)行掃描成像，并測(cè)定光密度值，觀察無排斥組在不同數(shù)量生物發(fā)光胰島移植后，胰島植入?yún)^(qū)域的光密度強(qiáng)弱，探討光密度與植入胰島數(shù)量的相關(guān)性；觀察有排斥組胰島植入?yún)^(qū)域光密度隨時(shí)間變化的規(guī)律，并同期監(jiān)測(cè)受體小鼠隨機(jī)血糖，比較光密度和隨機(jī)血糖變化時(shí)間。對(duì)皮下及腎包膜下同時(shí)移植模型，在移植后60d取無排斥組植入胰島的皮下脂肪和腎臟標(biāo)本，在移植后7d和10d取有排斥組相同標(biāo)本，常規(guī)組織

5、切片進(jìn)行HE染色和AF染色，觀察組織內(nèi)植入胰島的形態(tài)、胰島B細(xì)胞功能和胰島區(qū)域炎性反應(yīng)程度，并將組織學(xué)變化時(shí)間與光密度及血糖變化時(shí)間(皮下移植模型有排斥組)進(jìn)行對(duì)比。
　　 結(jié)果：在皮下移植模型中，無排斥組胰島植入?yún)^(qū)光密度值與植入胰島數(shù)量呈正相關(guān)，有排斥組植入?yún)^(qū)光密度值在移植后早期升高，隨后下降，而隨機(jī)血糖則先降低后升高，光密度開始下降的時(shí)間早于隨機(jī)血糖開始升高的時(shí)間，二者差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在皮下及腎包膜下同時(shí)移植模型中，無排斥

6、組移植后60d不同移植部位的胰島均形態(tài)完整，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，B細(xì)胞內(nèi)含大量分泌顆粒；有排斥組移植后7d可見胰島植入?yún)^(qū)域周圍呈輕度炎性反應(yīng)，B細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒減少，移植后10d可見植入?yún)^(qū)域重度炎性反應(yīng)，胰島形態(tài)破壞及B細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒減少。在相同時(shí)間點(diǎn)，兩個(gè)移植部位的組織學(xué)變化程度均相同，移植于皮下脂肪內(nèi)的生物發(fā)光胰島，可以作為深部器官內(nèi)植入胰島生存狀態(tài)的標(biāo)志。組織學(xué)變化時(shí)間與光密度和隨機(jī)血糖變化時(shí)間(皮下移植模型有排斥組)相符。
　　

7、 結(jié)論：通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)的胰島BLI，可在活體受體及時(shí)、直觀、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)植入胰島存活狀態(tài)，并可用移植于皮下脂肪內(nèi)的生物發(fā)光胰島，作為深部器官內(nèi)植入胰島的標(biāo)志，解決BLI應(yīng)用于臨床的障礙。BLI是臨床胰島移植術(shù)后監(jiān)測(cè)的良好選擇，也為相關(guān)研究提供了重要工具。
　　 第二部分、轉(zhuǎn)入胰島素基因胰島的胰島素合成功能研究
　　 目的：已有研究證明，轉(zhuǎn)入外源性胰島素基因的人類胰島，在受高濃度葡萄糖刺激時(shí)，可比正常胰島分泌更多的胰島

8、素，在胰島移植模型中，此種轉(zhuǎn)基因胰島具備更高的逆轉(zhuǎn)糖尿病受體高血糖的能力。本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)制作具有雙胰島素系統(tǒng)的胰島模型，并模擬移植后體內(nèi)損傷因素，從細(xì)胞內(nèi)胰島素含量的角度，探討轉(zhuǎn)入胰島素基因胰島的合成功能特性，并探討當(dāng)損傷因素存在時(shí)，其胰島素合成功能是否比正常胰島具有更強(qiáng)的抵抗力，從而進(jìn)一步揭示此種轉(zhuǎn)基因胰島的生物學(xué)特性。
　　 方法：自正常C57/B6(B6)小鼠胰腺分離胰島，將人類前胰島素基因轉(zhuǎn)入這些胰島并表達(dá)，制作可

9、表達(dá)內(nèi)源性和外源性兩種胰島素的雙胰島素模型，并在體外隨機(jī)分組進(jìn)行正常培養(yǎng)或加入促炎細(xì)胞因子培養(yǎng)，在設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)取胰島樣品，經(jīng)超聲裂解后分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)不同種類胰島素含量，觀察它們?cè)诓煌囵B(yǎng)條件下的變化的規(guī)律，并計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)胞內(nèi)胰島素總含量，與正常胰島進(jìn)行對(duì)比。
　　 結(jié)果：在正常培養(yǎng)中，正常小鼠胰島與轉(zhuǎn)基因小鼠胰島細(xì)胞內(nèi)胰島素總含量，在培養(yǎng)過程中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并在9d內(nèi)保持穩(wěn)定，而轉(zhuǎn)基因胰島細(xì)胞內(nèi)人類胰島素含量則隨時(shí)間逐漸增高；在加

10、入促炎細(xì)胞因子的培養(yǎng)中，正常小鼠胰島與轉(zhuǎn)基因小鼠胰島細(xì)胞內(nèi)胰島素總含量，均自加入細(xì)胞因子后第5d至6d開始逐漸下降，但在相同時(shí)間點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，轉(zhuǎn)基因小鼠胰島細(xì)胞內(nèi)人類胰島素含量亦有相同變化規(guī)律。
　　 結(jié)論：以往研究所證明的，轉(zhuǎn)入外源性胰島素基因胰島比正常胰島具有更高的逆轉(zhuǎn)高血糖能力，并非由于其細(xì)胞內(nèi)含有更多的胰島素，而是因?yàn)樵诟咛谴碳r(shí)，能夠合成釋放更多的胰島素。轉(zhuǎn)基因胰島的胰島素合成功能對(duì)細(xì)胞因子不具有更強(qiáng)的抵抗力，而是與