基于大鼠肝臟微粒體細(xì)胞色素P450酶系的甘遂和甘草配伍作用研究.pdf

1、[目的] 研究中藥十八反中甘遂和甘草配伍對(duì)動(dòng)物的影響和對(duì)細(xì)胞色素P450氧化酶系的誘導(dǎo)、抑制作用。確定影響細(xì)胞色素P450氧化酶的亞型，并對(duì)其進(jìn)行定性及定量研究。可望揭示部分中藥十八反藥物相反的分子機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。 [方法] (1)通過(guò)觀察大鼠生存狀態(tài)和肝臟組織病理變化確證甘遂和甘草是否存在相反作用； (2)通過(guò)比較雙向凝膠電泳技術(shù)和單向凝膠電泳技術(shù)分離后的蛋白經(jīng)生物質(zhì)譜鑒定的P450蛋白亞

2、型種類(lèi)，建立分離鑒定大鼠肝臟微粒體細(xì)胞色素P450同工酶的方法； (3)通過(guò)RT-PCR技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)對(duì)經(jīng)鑒定的各細(xì)胞色素P450同工酶進(jìn)行半定量研究； (4)采用酶和底物體外孵育的辦法，通過(guò)高效液相色譜和核酸蛋白分析儀對(duì)其特異性產(chǎn)物的絕對(duì)定量來(lái)比較各處理組細(xì)胞色素P450同工酶的活性，以確定甘遂和甘草配伍對(duì)細(xì)胞色素P450同工酶的影響。 [結(jié)果] (1)經(jīng)對(duì)大鼠生存狀態(tài)和肝臟組織病理變化比較，

3、合用后比單獨(dú)使用時(shí)生存狀態(tài)變差、肝臟病理?yè)p傷加重； (2)用單向凝膠電泳技術(shù)分離和生物質(zhì)譜技術(shù)確認(rèn)了大鼠肝臟微粒體中至少存在10個(gè)P450蛋白亞型，并對(duì)其中3個(gè)有重要臨床意義的同工酶CYP1A2、CYP2E1和CYP3A2進(jìn)行了研究； (3)經(jīng)RT-PCR技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)對(duì)CYP1A2、CYP2E1和CYP3A2進(jìn)行半定量研究，得出甘遂、甘草單用以及合用在物質(zhì)的含量上對(duì)這3種同工酶存在不同的影響； (4)

4、經(jīng)對(duì)CYP1A2、CYP2E1和CYP3A2酶的活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確認(rèn)甘遂、甘草單用以及合用在物質(zhì)的功能上對(duì)這3種同工酶存在不同的影響。 [結(jié)論] (1)成功的建立了基于凝膠電泳和生物質(zhì)譜的P450同工酶的分離和鑒定方法，多于國(guó)外2002年發(fā)表的鑒定出3個(gè)亞型的結(jié)果，為中藥“十八反”中其它藥對(duì)基于大鼠肝臟細(xì)胞色素P450酶系的研究奠定了基礎(chǔ)； (2)從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的層面提示甘遂和甘草確實(shí)存在相反作用，作用的結(jié)果是使

5、藥物的肝臟毒性增強(qiáng)； (3)從CYP1A2、CYP2E1和CYP3A2物質(zhì)基礎(chǔ)和功能兩個(gè)方面提示甘遂和甘草存在基于藥物代謝酶的相反作用； (4)CYP1A2和CYP2E1主要激活前致癌物和前毒物，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)甘遂中即含有此類(lèi)成分，且有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)CYP1A2和CYP2E1活性與許多癌癥的發(fā)病相關(guān)。研究證實(shí)合用組比對(duì)照和單用組此兩種酶的含量和活性都有所增加，提示合用后增加了罹患腫瘤的機(jī)率； (5)CYP3A2代謝臨床上6