在感染柯薩奇B-,3-病毒的乳鼠心肌細(xì)胞中IL-18對STAT-,3-，ERK，NF-κB通路的影響及相關(guān)性研究.pdf

1、【目的】①研究IL-18對感染柯薩奇B3病毒(CoxsackieB3virusCVB3)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用；②Janus激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(Januskinasessignaltransducersandactivatorsoftranscription，JAK-STAT)，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路(extracellularsignal-regulationkinaseERK通路)，核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)是細(xì)胞生長增殖的主要3

2、條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過研究STAT3，ERK，NF-κB的活化蛋白P-STAT3，P-ERK，NF-κBp65在感染病毒的心肌細(xì)胞中的表達(dá)來探討病毒感染心肌細(xì)胞的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。探索核轉(zhuǎn)錄因子抑制劑吡咯基二硫氨基甲酸酯(PyrrolidineDithiocarbamate,PDTC)對病毒感染搏動心肌細(xì)胞的作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。③探討在感染柯薩奇B3病毒的乳鼠心肌細(xì)胞中IL-18對STAT3,ERK，NF-κB通路的影響及相關(guān)性。

3、 【方法】第一部分IL-18對感染柯薩奇B3病毒乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用①心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)在無菌條件下取出生2天內(nèi)wister大鼠心臟，剪成1-2mm碎片，置于0.1％胰酶中，37℃10分鐘消化3次，每次消化后吹打，收集消化液加等體積20％胎牛血清培養(yǎng)液終止消化，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，沉淀混勻制成細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器嚴(yán)格計(jì)數(shù)后，分裝于24孔、96孔組織培養(yǎng)板，每孔中每ml生長液接種5×105細(xì)胞。37℃，5％CO2培養(yǎng)48h，換

4、液，72h細(xì)胞搏動后用于試驗(yàn)。 ②IL-18最大無毒劑量的觀察將培養(yǎng)3d的心肌細(xì)胞換液后加入不同濃度IL-18：2，4，6，8，10，20，30，40ng/ml，在培養(yǎng)的2、5d，觀察細(xì)胞形態(tài)，搏動頻率及LDH、CK。 ③不同濃度IL-18對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用心肌細(xì)胞感染模型的建立：將柯薩奇B3M株(CVB3M)在心肌細(xì)胞上測50％組織感染率(TCID50)，選擇100TCID50作為實(shí)驗(yàn)接種濃度，并加入不同濃度IL-1

5、8，觀察細(xì)胞形態(tài)及搏動變化，并在第2、5d測定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH與CK的含量。 1.5IL-18對感染病毒心肌細(xì)胞CPE和心肌酶譜的影響將分離培養(yǎng)3d的心肌細(xì)胞分為4組，感染組(n=10)：用CVB3感染心肌細(xì)胞；干預(yù)組(n=10)：心肌細(xì)胞感染病毒后加入IL-18(8ng/ml)；IL-18組(n=6)：正常心肌細(xì)胞加入IL-18(8ng/ml)；對照組(n=7)；正常心肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)實(shí)施后觀察細(xì)胞形態(tài)及搏動變化，并在第2、5d

6、測定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH與CK的含量。 第二部分NF-kB、ERK、STAT3在乳鼠病毒感染心肌細(xì)胞中的作用①心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)同前 ②心肌細(xì)胞感染模型的建立將柯薩奇B3M株(CVB3M株)，在心肌細(xì)胞上測50％組織感染率(TCID50)，選擇100TCID50作為實(shí)驗(yàn)接種濃度。將感染組在培養(yǎng)的第三天加入100TCID50CVB3病毒液100μl，同時(shí)在對照組細(xì)胞中加等量的維持液，并在同等情況下于培養(yǎng)第七天用細(xì)胞變性效果法

7、(CellcytopathiceffectCPE)觀察細(xì)胞病變。 ③抑制劑PDTC干預(yù)心肌細(xì)胞將擬行PDTC干預(yù)的心肌細(xì)胞，再加100TCID50CVB3病毒液100μl孵育，在37℃，5％CO2進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀察心肌細(xì)胞病變，直到孵病毒后第七天。 ④心肌蛋白制備各組細(xì)胞用0.02％EDTA懸起，離心棄上清。將細(xì)胞沉淀用PBS沖洗2次后加入細(xì)胞裂解液，冰上孵育15分鐘，10000r/min離心10min，取上清得到蛋白。

8、用BioRad試劑盒測定蛋白濃度。 ⑤免疫印跡(Westenblot)法測定各組NF-kB65,P-ERK,P-STAT3蛋白含量。⑥MTT法檢測細(xì)胞活性分為對照組，CVB3感染組，PDTC干預(yù)組(CVB3+PDTC10μmol/l，CVB3+PDTC40μmol/l)。檢測各組細(xì)胞活性。 第三部分在感染柯薩奇B3病毒的乳鼠心肌細(xì)胞中IL-18對STAT3,ERK，NF-κB通路的影響 ①心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)同前②

9、心肌細(xì)胞感染模型的建立同前③IL-18干預(yù)心肌細(xì)胞將含不同濃度IL-182，4，6，8，10，20，30，40ng/ml培養(yǎng)基分別加入病毒感染的心肌細(xì)胞，每天用以上濃度的IL-18換液，持續(xù)7天。 ④心肌蛋白制備同前⑤免疫印跡(Westenblot)法測各組P-STAT3，P-ERK，NF-kBP65蛋白含量 【結(jié)果】第一部分IL-18對感染柯薩奇B3病毒乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用①感染組感染病毒后第2、5天心肌細(xì)胞病變程度

10、較其余3組明顯，LDH和CK濃度明顯升高，與其余3組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。②IL-18濃度≥40ng/ml時(shí)對正常心肌細(xì)胞有毒性作用。③IL-18濃度在4～20ng/ml范圍內(nèi)對感染心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。 第二部分NF-kB、ERK、STAT3在乳鼠病毒感染心肌細(xì)胞中的作用①感染組與對照組比較，心肌細(xì)胞活性明顯降低，CPE加重；②感染組NF-kBP6，P-ERK,P-STAT3蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P＜0.01

11、)。③PDTC干預(yù)組心肌細(xì)胞活性明顯低于感染組，CPE較感染組輕，NF-kBP65蛋白表達(dá)明顯低于感染組(P＜0.01)。 第三部分在感染柯薩奇B3病毒的乳鼠心肌細(xì)胞中IL-18對STAT3，ERK，NF-κB通路的影響 ①M(fèi)TT法顯示IL-18為40ng/ml時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)病變，而8ngm/l時(shí)細(xì)胞存活率最高(P＞0.05)。 ②Westenblot示在感染柯薩奇B3病毒的乳鼠心肌細(xì)胞中IL-18對STAT3，ER

12、K，NF-κB均有抑制作用，但對ERK，STAT3的抑制作用更明顯。 【結(jié)論】①IL-18可以抑制CVB3對心肌細(xì)胞的損傷，對CVB3感染的心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。 ②coxsackieB3病毒在感染早期可導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能為激活NF-kB,ERK，STAT3信號通路，PDTC對乳鼠病毒感染心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。 ③ERK,STAT3信號通路在IL-18對感染柯薩奇B3病毒的乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用中起了重