蝶蛹金小峰寄生對寄主轉錄組的影響及三種毒蛋白分子特性分析.pdf

1、菜粉蝶為十字花科蔬菜重要的害蟲，其危害嚴重，蝶蛹金小蜂為菜粉蝶的蛹期優(yōu)勢寄生蜂(Hu，1983)。寄生蜂雌蜂將一種或多種寄生因子注入寄主體內，用來抑制寄主免疫、調控寄主生長發(fā)育和營養(yǎng)代謝等生理活動。這些寄生因子包括，毒液、多分DNA病毒(PDVs)、類病毒顆粒，卵巢蛋白等(Pennacchio et al.，2006)。在不含有PDVs的寄生蜂中，毒液為抑制寄主免疫的關鍵因子(Asgari et al.，2011)。寄生蜂除了能夠抑制寄

2、主免疫外，還能夠通過影響寄主的神經肽基因來間接影響寄主的發(fā)育(Shi et al.，2015)。前期研究表明，菜粉蝶蛹在注射蝶蛹金小蜂毒液30分鐘后其免疫反應就能被抑制(Fang et al.，2010)。因此，本研究通過比較寄生1小時和未寄生的菜粉蝶蛹轉錄組，來探究寄生對寄主整體基因表達的影響。同時，對蝶蛹金小蜂的三個毒液蛋白的生理功能展開了研究。
　　1.通過比較分析寄生和非寄生的菜粉蝶蛹轉錄組，研究在寄生后的早期階段，寄主體

3、內整體基因的轉錄水平的變化，特別是免疫相關基因的變化。通過拼接菜粉蝶蛹轉錄組，得到了45，639個轉錄本和27，659個非冗余Unigenes。Unigene的平均長度為790bp。27，659個Unigenes中，共有18，377個Unigene被成功注釋。同時，還鑒定出557個差異表達基因，其中有21個為免疫相關基因。寄生導致大部分模式識別受體基因表達被下調，而絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達量被上調。本研究為蝶蛹金小蜂與其寄主菜粉蝶在分子

4、水平上的互作研究奠定了理論基礎。
　　2.γ-谷氨酰轉肽酶在生物體內廣泛存在，γ-谷氨酰轉肽酶通常參與谷胱甘肽的代謝，在抗氧化、解毒和炎癥過程中起關鍵作用。通過分析蝶蛹金小蜂毒腺轉錄組和蛋白質組，發(fā)現(xiàn)了一個可能編碼γ-谷氨酰轉肽酶蛋白(PpGGT)的基因序列。通過比較毒腺和殘體（不含毒腺）的轉錄組，發(fā)現(xiàn)PpGGT在毒腺中高表達。通過RACE技術，克隆得到了PpGGT的基因序列。序列分析表明，編碼PpGGT的cDNA序列全長2274

5、bp，ORF長1959bp，共編碼652個氨基酸殘基。采用Editseq軟件包對PpGGT基因序列進行預測，其理論分子量大小為72.196kDa，等電點為8.25。多序列比對顯示，PpGGT的成熟肽由大小兩個亞基組成。定量PCR、Western blot和免疫組化結果表明，PpGGT在蝶蛹金小蜂毒器官中高表達，在其它組織中，幾乎檢測不到。PpGGT在羽化后1到6天的毒器官中都有表達，第六天表達量最高。在毒液和重組表達的PpGGT中，都能

6、夠檢測到GGT的活力。推測PpGGT能夠通過影響寄主體內的谷胱甘肽代謝平衡，從而誘導血細胞的凋亡。
　　3.幾丁質結合蛋白存在于多種生物中，并參與多種重要的生理活動。我們通過分析蝶蛹金小蜂毒腺轉錄組發(fā)現(xiàn)了蝶蛹金小蜂幾丁質結合蛋白(PpCBP)基因的部分序列。通過RACE技術，克隆得到PpCBP的全長cDNA序列。PpCBP基因能夠編碼96個氨基酸，包括一個分泌信號肽和一個Peritrophin-A domain。進化樹分析顯示Pp

7、CBP的幾丁質結合功能域與麗蠅蛹集金小蜂的幾丁質結合功能域以及墨吉對蝦卵巢膜聚為一類。定量PCR、Western blot和免疫組織定位結果顯示，PpCBP在蝶蛹金小蜂毒器官中高表達。時間動態(tài)分析表明，PpCBP在蝶蛹金小蜂羽化后第4天的毒器官中表達量最高。結合測定結果表明，重組PpCBP能夠與幾丁質相結合，而不能與纖維素相結合。蝶蛹金小蜂毒囊中含有幾丁質，因此推測PpCBP為毒囊的組成成分，并保護毒囊免受毒腺中活性組分的傷害。

8、　　4.絲氨酸蛋白酶同源物參與昆蟲的多種生理活動。通過分析蝶蛹金小蜂毒腺轉錄組，我們發(fā)現(xiàn)了蝶蛹金小蜂絲氨酸蛋白酶同源物(PpSPH29)的部分序列。通過比較毒腺和殘體（不含毒腺）的轉錄組，發(fā)現(xiàn)PpSPH29在毒腺中高表達。通過RACE技術，從蝶蛹金小蜂毒腺中克隆獲得了PpSPH29的cDNA全長序列。PpSPH29基因全長1065bp，共編碼270個氨基酸。通過Editseq預測顯示，PpSPH29的等電點為4.4，分子量大小為29.4