缺血再灌注腦損傷后蛇床子素的腦保護作用研究.pdf

1、蛇床子是草本植物蛇床的干燥成熟果實，自然資源十分豐富[1]。其主要藥理活性成分是香豆素類化合物，蛇床子素（osthole，OST）即其中香豆素類化合物的主要成分[2]。近期研究發(fā)現，蛇床子素具有植物雌激素樣作用，且可影響部分酶的活性、蛋白的合成、鈉鉀ATP酶活性，具有潛在的神經保護作用[3]。Homer1a蛋白可干擾Ⅰ型代謝性谷氨酸受體（metabotropicglutamatereceptorⅠ，mGluR1a）從胞漿內質網到突觸后膜

2、的轉運及其在突觸后膜的定位，并可影響細胞Ca2+通道、Shank、細胞骨架蛋白等的功能，具有神經保護作用。本研究利用離體培養(yǎng)的大鼠皮層細胞氧糖剝奪模型（oxygenglucosedeprivation，OGD）和在體大鼠四血管阻塞法（4-vesselocclusion，4VO）腦缺血再灌注模型，研究蛇床子素后處理在缺血再灌注腦損傷后的腦保護作用及Homer1a在其中的表達情況，旨在闡明蛇床子素的神經保護作用和該藥物保護作用的可能的分子生

3、物學機制。
　　實驗一：體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經元氧糖剝奪后蛇床子素的神經保護作用及其對Homer蛋白表達的影響
　　目的：造成高密度培養(yǎng)神經元氧糖剝奪后，利用OST進行干預，觀察其在缺血再灌注神經元損傷中的神經保護作用。方法步驟一：建立高密度大鼠腦皮層神經元體外培養(yǎng)方法；培養(yǎng)7d后，通過免疫組織化學法鑒定培養(yǎng)神經元的純化率。步驟二：將培養(yǎng)7d的神經元分為空白對照組（Sham組）、單純氧糖剝奪再灌注損傷組（Con組）、氧糖剝奪

4、再灌注損傷后不同劑量蛇床子素干預組（OST0.01μΜ組、OST0.1μΜ組、OST1μΜ組、OST10μΜ組、OST100μΜ組）；除Sham組外，其余各組均用無糖培養(yǎng)基置換正常培養(yǎng)基，并剝奪氧氣供應4小時，換回正常培養(yǎng)條件造成缺血再灌注損傷，然后用蛇床子素對不同劑量OST組進行干預；24h后運用生物化學手段檢測各組間Caspase3和Homer1a表達情況。結果：神經元體外培養(yǎng)7d，光鏡下見細胞核大而清晰、透亮，圓形或卵圓形，胞體呈

5、多形性，胞質透亮，神經元突起間相互聯(lián)系，形成網絡結構。anti-β-tubulin-Ⅲ和NF200免疫組織化學染色細胞陽性率達95％。氧糖剝奪4h恢復氧糖供應24h后，生化分析結果顯示，各OST干預組Caspase3表達均低于Con組而高于Sham組，Homer1a表達則高于Con組。結論：缺血再灌注神經元損傷后，蛇床子素可起到一定程度的保護作用；在對抗該損傷的過程中，Homer1a表達可能發(fā)揮一定作用。
　　實驗二：SD大鼠缺血

6、再灌注腦損傷后蛇床子素的神經保護作用及其對Homer蛋白表達的影響
　　目的：觀察在整體動物缺血再灌注腦損傷后OST的神經保護作用。方法步驟一：建立改進的胸廓上口入路大鼠四血管阻塞法（4-vesselocclusion，4VO）腦缺血再灌注模型，其具體操作過程簡述如下：將大鼠麻醉，打開胸廓上口，分離雙側鎖骨下動脈起始段；用動脈夾夾閉雙側鎖骨下動脈起始段和雙側頸總動脈，15min后撤除動脈夾，恢復腦血流再灌注。步驟二：實驗用SD大鼠

7、50只隨機分為假手術組（Sham組）、單純缺血再灌注損傷組（Con組）和缺血再灌注損傷后不同劑量OST干預組（OST5mg/kg組、OST25mg/kg組、OST125mg/kg組）；除Sham組動物僅接受手術，不經歷動脈夾閉過程外，各組動物均接受4VO處理；恢復再灌注1小時后，各劑量OST干預組動物分別腹腔注射蛇床子素5mg/kg、25mg/kg、125mg/kg。再灌注24h后，各實驗組動物進行神經功能學評分，而后，每組隨機選取3只

8、動物用于Caspase3和Homer1a蛋白半定量分析，各組剩余的動物用于分析海馬CA1區(qū)細胞組織形態(tài)學變化。結果：改進的模型操作方法簡化了原模型制作的操作程序，減小了手術損傷，且缺血效果穩(wěn)定可靠。各OST組大鼠的行為學評分和組織形態(tài)學分析結果均明顯優(yōu)于Con組（P<0.01），并在25mg/kg劑量時表現出最大神經保護效果；各OST組大鼠海馬組織Caspase3表達水平顯著低于Con組，Homer1a表達均高于Con組。結論：在缺血再