慢性點(diǎn)燃癲癇大鼠腦內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)變化及其與BDNF的相關(guān)性研究.pdf

1、目的: 1.觀察戊四氮(PTZ)點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠腦內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GAT-1)、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GLT-1)的表達(dá)及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)信號(hào)途徑Trk蛋白的磷酸化改變。 2.觀察BDNF對(duì)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)和功能的影響，結(jié)合磷酸化Trk蛋白的檢測(cè)，探討B(tài)DNF對(duì)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控作用及其在慢性癲癇過程中的意義。 方法和結(jié)果: 1.建立了穩(wěn)定的PTZ點(diǎn)燃大鼠慢性癲

2、癇模型。SD大鼠兒已獲Ⅲ級(jí)以上發(fā)作者，被認(rèn)為完全點(diǎn)燃，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的改良，成功點(diǎn)燃大鼠占90％。 2.采用免疫組化技術(shù)，觀察了正常及PTZ點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠發(fā)作不同時(shí)相點(diǎn)(3、7、14天)海馬和顳葉皮層區(qū)GAT-1和GFAP表達(dá)改變。用圖像分析軟件分析各組陽(yáng)性反應(yīng)物平均光密度值，并計(jì)算GAT-1和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)在癲癇組與正常組間的比值。結(jié)果顯示PTZ點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠GFAP、GAT-1表達(dá)與正常對(duì)照組均存在顯著差

3、異，海馬和顳葉皮層區(qū)均呈現(xiàn)明顯的增高，點(diǎn)燃7天組增高最為顯著；其中GAT-1在癲癇組與正常組間比值明顯高于GFAP比值。 3.應(yīng)用Western印跡方法檢測(cè)了正常及發(fā)作7天大鼠海馬及顳葉皮層區(qū)GAT-1、GFAP、GLT-1及磷酸化-酪氨酸激酶受體(p-Trk)表達(dá)變化。結(jié)果顯示點(diǎn)燃組海馬和顳葉皮層區(qū)GAT-1、GFAP、GLT-1、p-Trk與正常對(duì)照相比均存在明顯增高。計(jì)算海馬及顳葉皮層區(qū)上述分子在癲癇組與正常對(duì)照組間的吸光

4、度比值，GAT-1比值明顯大于其它三種分子。提示癲癇發(fā)作后多種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)均存在明顯改變，GAT-1的增高可能存在膠質(zhì)細(xì)胞外來源。 4.采用免疫熒光雙標(biāo)法觀察了正常及癲癇發(fā)作后7天大鼠腦內(nèi)p-Trk和GFAP的表達(dá)及其位置關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)燃組GFAP與p-Trk雙陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照組。提示癲癇發(fā)作后表達(dá)p-Trk的星形膠質(zhì)細(xì)胞比例增高。 5.分離培養(yǎng)并純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)GFAP免疫染色鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞比

5、例大于95％。 6.采用Western印跡實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了不同濃度BDNF(50、100、200ng/l)作用不同時(shí)間(1、3、7、14天)后培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1和p-Trk的表達(dá)。BDNF作用組星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GLT-1，p-Trk表達(dá)與對(duì)照組相比存在顯著差異，其中BDNF濃度(100ng/l)差異最為顯著，GLT-1以BDNF作用3天組差異最為明顯，p-Trk以BDNF作用7天組差異最為明顯。提示BDNF能夠促進(jìn)培養(yǎng)的星形膠

6、質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1表達(dá)增高，并可能與BDNF/p-Trk途徑相關(guān)。 7.應(yīng)用同位素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)，通過在培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞體系(BDNF作用組和對(duì)照組)中加入DL-[2、3-3H]谷氨酸，孵育20分鐘后測(cè)定星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)DL-[2、3-3H]谷氨酸含量。結(jié)果顯示BDNF作用星形膠質(zhì)細(xì)胞DL-[2、3-3H]谷氨酸含量明顯高于正常對(duì)照組，其中以BDNF濃度(100ng/l)增高最為明顯。提示BDNF能夠增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取

7、功能。 8.應(yīng)用Ca2+熒光成像技術(shù)，在激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)了BDNF作用下培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示BDNF能刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯上調(diào)，并呈現(xiàn)細(xì)胞異質(zhì)性。提示BDNF可以廣泛參與星形膠質(zhì)細(xì)胞功能活動(dòng)。 結(jié)論: 本研究結(jié)果表明，戊四氮點(diǎn)燃大鼠腦內(nèi)尤其是海馬及顳葉皮質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞存在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GAT-1和GLT-1的表達(dá)上調(diào)及BDNF信號(hào)途徑Trk蛋白磷酸化的增強(qiáng)，同時(shí)BDN