CatSper作為不育病因檢查和避孕靶點(diǎn)的探索性研究.pdf

1、CatSper家族特異性表達(dá)于精子，并為雄性生育所必需，這使研究者們認(rèn)為有兩方面的應(yīng)用前景：作為男性不育病因檢查的切入點(diǎn)和理想的避孕靶點(diǎn)。本論文分兩部分分別對(duì)這兩方面作了一些前期的探索性研究。
　　 第一部分
　　 實(shí)驗(yàn)一、
　　 背景與目的：CatSper家族的四個(gè)成員被認(rèn)為是形成異四聚體而行使其功能，但近期對(duì)于CatSper家族四個(gè)成員表達(dá)定位的爭(zhēng)論，及其他能與CatSper結(jié)合的蛋白的發(fā)現(xiàn)，使CatSper

2、家族四個(gè)成員的關(guān)系變得復(fù)雜和不明確。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^定量檢測(cè)和比較CatSper家族四個(gè)成員的mRNA在小鼠睪丸發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)變化，明確CatSper家族成員在睪丸發(fā)育中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究CatSper家族成員間的關(guān)系及其功能單位，以及研究和應(yīng)用CatSper提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：在普通逆轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈反應(yīng)體系中添加熒光染料SYBR GREEN Ⅰ建立熒光實(shí)時(shí)RT-PCR體系，以β-Actin作為內(nèi)參，用相對(duì)定量法

3、檢測(cè)CatSper家族四個(gè)成員的mRNA在出生后8，11，15，18，21，25，28，35，42，56和120d齡C57BL/6小鼠睪丸發(fā)育過程中的表達(dá)。熒光實(shí)時(shí)RT-PCR循環(huán)采用四步法，即在靠近擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值前采集熒光，以消除引物二聚體及非特異性產(chǎn)物的影響。
　　 結(jié)果：CatSper家族四個(gè)成員的mRNA在小鼠睪丸發(fā)育中共有三種不同的表達(dá)模式，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)及上調(diào)時(shí)間點(diǎn)的不同：
　　 1)CatSper1 m

4、RNA在18d齡小鼠睪丸開始表達(dá)，在25d、28d齡和42d齡表達(dá)明顯上調(diào)，與各自前一時(shí)間天齡小鼠睪丸相比，差別有顯著性意義。自42d后上調(diào)緩慢，至成年小鼠時(shí)達(dá)到最高水平。2)CatSper2 mRNA在8d齡小鼠睪丸就可被檢測(cè)到，繼而在18d、35d齡表達(dá)明顯上調(diào)，與各自前一時(shí)間天齡小鼠睪丸相比，差別有顯著性意義。35d 后水平稍下降，因此，CatSper2 mRNA表達(dá)高峰在35d齡。
　　 3)CatSper3和CatSp

5、er4 mRNA在小鼠睪丸發(fā)育過程中的表達(dá)啟動(dòng)及調(diào)節(jié)模式相似：在15d齡小鼠睪丸表達(dá)啟動(dòng)，在21d、25d齡和35d齡表達(dá)明顯上調(diào)，與各自前一時(shí)間天齡小鼠睪丸相比，差別有顯著性意義，之后表達(dá)逐漸上調(diào)，至成年小鼠時(shí)達(dá)到最高水平。
　　 結(jié)論：CatSper家族四個(gè)成員的mRNA在小鼠睪丸發(fā)育中有不同表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究CatSper家族成員間的關(guān)系及其功能單位提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為研究和應(yīng)用CatSper家族奠定一定基礎(chǔ)。
　

6、　 實(shí)驗(yàn)二、
　　 背景與目的：本實(shí)驗(yàn)的目的是檢測(cè)CatSper家族四個(gè)成員的mRNA在人成熟精子中存在的情況，并探討人射出精子CatSper家族mRNA水平與精子質(zhì)量的關(guān)系，以及CatSper家族在人精子前向運(yùn)動(dòng)中的作用，為CatSper家族作為男性不育病因檢查和研究提供一個(gè)新的靶點(diǎn)和途徑。
　　 方法：參照世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)選取正常精液標(biāo)本，為明確CatSper家族mRNA是否存在于人射出精子中，關(guān)鍵是要排除精液中睪

7、丸生精細(xì)胞的污染。采用Percoll(80[％]和40[％]兩個(gè)濃度)純化精子兩次，顯微鏡下確認(rèn)純化效果后用于提取RNA。用普通RT-PCR檢測(cè)CatSper家族mRNA是否存在于人射出精子中，并同步擴(kuò)增C-Kit，排除精液中睪丸生精細(xì)胞的污染。
　　 為比較高、低活力精子中CatSper家族mRNA水平的差異，正常精液標(biāo)本用四層密度梯度Percoll(自下而上濃度分別95，76，57和47.5[％])離心分離出高活力和低活力精

8、子。要求低活力精子a+b級(jí)精子活力小于30[％]，且高活力精子a+b級(jí)精子活力大于90[％]，低活力精子和高活力精子的存活率均大于85[％]。同上排除精液中睪丸生精細(xì)胞的污染，提取RNA，以β-Actin作為內(nèi)參，熒光實(shí)時(shí)RT-PCR(四步法)相對(duì)定量法檢測(cè)CatSper家族成員的mRNA在高活力和低活力精子中的水平并比較。
　　 結(jié)果：共對(duì)5例標(biāo)本進(jìn)行了純化，均達(dá)到純化標(biāo)準(zhǔn)并用于檢測(cè)CatSper家族成員mRNA存在情況。這5

9、例標(biāo)本均檢測(cè)到CatSper2和CatSper3的mRNA存在，而僅在2例標(biāo)本中檢測(cè)到CatSper1 mRNA的存在，這5例純化精子標(biāo)本中均未檢測(cè)到CatSper4 mRNA的存在。
　　 共對(duì)12例標(biāo)本進(jìn)行了高、低活力精子的分離，有10例達(dá)到純化標(biāo)準(zhǔn)及活力、存活率的要求，用于檢測(cè)了CatSper家族成員在高、低活力精子中的mRNA水平。CatSper2、3 mRNA的水平在各標(biāo)本中的變化范圍較大，經(jīng)β-Actin標(biāo)準(zhǔn)化后，各

10、標(biāo)本間仍有數(shù)倍乃至數(shù)十倍的差異，但仍呈正態(tài)分布。除了有一例標(biāo)本低活力精子中CatSper3 mRNA的水平略高于高活力精子外(0.88 vs.0.82)，在其他標(biāo)本中，低活力精子中CatSper2、3 mRNA的水平均低于高活力精子。經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，高、低活力精子間，CatSper2、3 mRNA的水平差異有顯著性意義(P<0.01)。高活力和低活力精子的活率差異無顯著性意義(92.6±1.6 vs.91.7±1.7，P=0.228)。<

11、br>　　 結(jié)論：為應(yīng)用人成熟精子CatSper家族mRNA作為不育病因檢查和研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考，精子中CatSper2和CatSper3 mRNA水平檢測(cè)可考慮作為男性不育，尤其是弱精子癥病因檢查的新靶點(diǎn)。但CatSper2和CatSper3 mRNA水平存在較大的個(gè)體差異，所以，研究其與不育的關(guān)系可能需要較大的樣本。
　　 第二部分
　　 實(shí)驗(yàn)一、
　　 背景與目的：CatSper1是CatSper家族

12、第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員。CatSper1在小鼠精子中的表達(dá)、定位及在小鼠精子生理功能中的主要作用已基本明確，并被認(rèn)為是避孕及男性不育研究的理想靶點(diǎn)，但目前尚未見CatSper1在人精子中表達(dá)及其功能的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的目的是明確CatSper1在人睪丸、精子中表達(dá)及定位，為CatSper1的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：用Western Blot和間接熒光免疫組織化學(xué)檢測(cè)人睪丸組織和Percoll(80[％]和40[％]兩個(gè)濃度)純化

13、人精子中CatSper1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：CatSper1蛋白在人睪丸組織及人成熟精子中都有表達(dá)，在人睪丸表達(dá)于精子細(xì)胞，并定位于射出成熟精子尾部的主段。
　　 結(jié)論：CatSper1蛋白在人類睪丸呈減數(shù)分裂后表達(dá)方式，與小鼠CatSper1轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)于減數(shù)分裂后的結(jié)果相吻合；CatSper1蛋白在人精子表達(dá)的定位也與小鼠相同。這些都提示，CatSper1在人精子中的功能可能與小鼠是相同的。
　　 實(shí)驗(yàn)二、

14、
　　 背景與目的：目前尚未見以CatSper1為靶點(diǎn)進(jìn)行避孕研究的報(bào)道，也沒有特異性的拮抗劑。作為在精子功能及精卵結(jié)合方面起重要作用，且定位于精子膜上的精子特異性抗原，我們推測(cè)免疫避孕可能成為可行有效的途徑。離子通道自身免疫性疾病也表明，用針對(duì)離子通道的抗體阻斷其功能是有效可行的。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過觀察抗CatSper1跨膜區(qū)及胞外段的抗體在體外對(duì)人精子功能和小鼠精子體外授精能力的影響，探討CatSper1跨膜區(qū)及胞外段用于免

15、疫避孕的可能性，明確CatSper1用于免疫避孕的主要作用環(huán)節(jié)，也間接研究人精子CatSper1的功能。
　　 方法：間接熒光免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)所用的抗CatSper1多克隆抗體(所針對(duì)抗原為CatSper1的跨膜區(qū)及胞外段)與人、小鼠精子結(jié)合的特異性。按世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)選取正常精液標(biāo)本，經(jīng)SpermRinse上游優(yōu)化，與抗CatSper1
　　 多克隆抗體(終濃度為50 μg/ml)孵育，顯微鏡下觀察抗CatS

16、per1多克隆抗體是否引起精子凝集，計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)檢測(cè)抗體對(duì)精子活力和超活化運(yùn)動(dòng)的影響，考馬斯亮蘭G250染色觀察抗體對(duì)頂體反應(yīng)的影響。取BALB/c小鼠附睪尾部精子，在授精前與抗CatSper1多克隆抗體(終濃度為50 μg/ml)孵育90 min，觀察抗體預(yù)處理對(duì)精子體外授精能力的影響。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)所用的抗CatSper1多克隆抗體與人和小鼠精子均結(jié)合于精子尾部主段，未發(fā)現(xiàn)非特異性結(jié)合。終濃度為50 μ的g/m

17、l該抗體和精子體外培養(yǎng)：
　　 1)2 h后，顯微鏡下無精子凝集發(fā)生。
　　 2)1 h、2 h、4 h后，活力下降，與對(duì)照組相比，差異有顯著性意義(P<0.005)。且活力的降低主要表現(xiàn)為a級(jí)精子(快速前向運(yùn)動(dòng)精子)減少，與對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)的差異均有顯著性意義(P<0.01或P<0.005)。
　　 3)4 h后，對(duì)精子頂體反應(yīng)無明顯影響(P=0.61)。
　　 4)5 h后，對(duì)精子超活化運(yùn)動(dòng)有明顯

18、抑制作用(P<0.05)。
　　 BALB/c小鼠精子，在授精前經(jīng)50 μg/ml抗CatSper1多克隆抗體預(yù)處理90 min，受精率為45.8[％](77/168)，與對(duì)照組相(80.4[％]，123/153)比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次以精子特異性離子通道為靶點(diǎn)，體外探討了CatSper1用于免疫避孕的可能性和有效性?？笴atSper1跨膜區(qū)及胞外段的抗體通過特異性結(jié)合于精子Ca