照射后成纖維細胞促進食管鱗癌EMT及HDGF表達的實驗研究.pdf

1、背景：食管鱗癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者五年生存率仍然低于20％，放射治療是ESCC患者一項重要的治療方法。最近，有研究表明活化地腫瘤相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)與ESCC患者的差的預(yù)后及同步放化療后局部復(fù)發(fā)密切相關(guān)。越來越多的研究亦顯示放射線可以通過作用腫瘤間質(zhì)微環(huán)境影響腫瘤發(fā)生發(fā)展，由此豐富了放射線誘發(fā)腫瘤的證據(jù)。近

2、幾年來肝癌衍生生長因子（Hepatoma-derived growth factor，HDGF）引起了學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注，它既是具有促成纖維細胞有絲分裂活性的酸性多肽，也與多種腫瘤差的預(yù)后密切相關(guān);同時其表達變化與多種腫瘤的轉(zhuǎn)化、凋亡、血管生成以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。HDGF與ESCC患者的放療敏感性以及腫瘤復(fù)發(fā)亦有緊密聯(lián)系。CAFs與腫瘤轉(zhuǎn)移的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)聯(lián)，包括可以促進腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchyma

3、l transition，EMT)過程，而大量研究表明EMT可以賦予細胞遷移、侵襲能力以及誘導(dǎo)干細胞特性。并且已有多篇文獻證明間質(zhì)成纖維細胞可以通過EMT促進腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移。與此同時，最近越來越多的研究表明γ射線源照射成纖維細胞可以通過腫瘤間質(zhì)相互作用促進腫瘤發(fā)生以及侵襲生長。而X射線源照射成纖維細胞是否促進ESCC侵襲轉(zhuǎn)移及其機制尚有待于進一步研究。
　　目的：①旨在研究X射線對間質(zhì)成纖維細胞的作用以及照射后CAFs對ESC

4、C細胞的影響。②探討在放射線對ESCC與間質(zhì)成纖維細胞相互作用中的EMT相關(guān)蛋白以及HDGF表達變化。
　　方法：⑴分離及培養(yǎng)原代CAFs和正常成纖維細胞(Normal Fibroblasts，NFs)來研究ESCC腫瘤微環(huán)境內(nèi)的間質(zhì)成纖維細胞特點。為了證明CAFs沒有其他細胞成分混雜及其純度，利用成纖維細胞標記蛋白纖連蛋白(fibronectin)區(qū)分成纖維細胞與ESCC細胞。Western blotting驗證原代成纖維細胞高

5、表達a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)和不表達E-鈣粘蛋白(E-cadherin)，體現(xiàn)原代成纖維細胞的細胞特性。⑵在室溫條件下，用X射線源以不同劑量照射原代成纖維細胞，劑量率為400cGy/min。照射后收集條件培養(yǎng)液留待后續(xù)培養(yǎng)ESCC細胞試驗用。⑶采用侵襲實驗檢測與照射后(4Gy和8Gy)或未照射成纖維細胞(NFs和CAFs)共培養(yǎng)的ESCC細胞的侵襲能力。⑷采用Scattering實驗檢測照射后成纖維細胞的條件培養(yǎng)液對ESCC細胞

6、的Scattering能力的影響。⑸ESCC細胞和4Gy照射后成纖維細胞或未照射成纖維細胞均勻混合后種植于裸鼠右背側(cè)皮下，每組六只。每3天用游標卡尺測量腫瘤大小一次并記錄，腫瘤體積計算公式為:腫瘤體積(V)=（長徑×寬徑2）/2。⑹為了研究照射后成纖維細胞促進ESCC細胞的遷移及侵襲與EMT有關(guān)，western blotting檢測照射后成纖維細胞條件培養(yǎng)液和未照射成纖維細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時的ESCC細胞中上皮細胞標記物E-cad

7、herin和間質(zhì)細胞標記物波紋蛋白(vimentin)表達情況。并用免疫組化檢測β-鏈蛋白(β-catenin)在照射組裸鼠移植瘤內(nèi)的表達變化，未照射組為對照組。⑺為探討HDGF在放射線照射成纖維細胞促進ESCC細胞遷移與侵襲中的作用，采用western blotting檢測照射后成纖維細胞條件培養(yǎng)液和未照射成纖維細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時的ESCC細胞中HDGF表達情況。并用免疫組化檢測HDGF在照射組裸鼠移植瘤內(nèi)的表達變化，未照射組

8、為對照組。
　　結(jié)果：①從ESCC組織分離及培養(yǎng)的原代成纖維細胞保持成纖維細胞特性。用于本實驗的所有成纖維細胞均為10代以內(nèi)并表現(xiàn)為梭形細胞形態(tài)。3代以后的成纖維細胞E-cadherin未見表達，表明早期代數(shù)的成纖維細胞保持成纖維細胞特性。②由于上皮細胞EMT的時候Scattering能力會有所增強，具體表現(xiàn)為細胞與細胞之間的黏附作用消失并獲得較高活性的間質(zhì)細胞表型，Scattering實驗已被用于研究細胞的EMT和檢測細胞遷移誘

9、導(dǎo)能力。照射后成纖維細胞條件培養(yǎng)液增強ESCC細胞的Scattering能力并呈劑量依賴性。③研究表明ESCC細胞與未照射成纖維細胞共培養(yǎng)侵襲能力提高，當其與照射后成纖維細胞共培養(yǎng)其侵襲能力會得到進一步的增強。④結(jié)果顯示照射組中ESCC細胞E-cadherin呈劑量依賴性降低，vimentin隨劑量依賴性升高并在所有組中高表達。體內(nèi)體外實驗表明β-catenin在照射組中都表達升高，免疫組化結(jié)果顯示其在照射組腫瘤組織中的細胞核高表達及核

10、轉(zhuǎn)位。⑤照射后成纖維細胞促進ESCC生長，特別是在Eca-9706腫瘤細胞組中。體內(nèi)體外實驗表明照射后成纖維細胞增強照射組中腫瘤細胞及成纖維細胞中HDGF的表達。值得注意的是，與間質(zhì)成纖維細胞相鄰的腫瘤細胞HDGF在細胞核中有相對更高的表達，顯示成纖維細胞的旁分泌效應(yīng)。
　　結(jié)論：⑴照射后CAFs促進ESCC細胞侵襲及EMT，增強其Scattering能力。⑵照射后成纖維細胞誘導(dǎo)ESCC細胞β-catenin核轉(zhuǎn)位。⑶照射后成纖維