照射后成纖維細(xì)胞促進(jìn)食管鱗癌EMT及HDGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：食管鱗癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者五年生存率仍然低于20％，放射治療是ESCC患者一項(xiàng)重要的治療方法。最近，有研究表明活化地腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)與ESCC患者的差的預(yù)后及同步放化療后局部復(fù)發(fā)密切相關(guān)。越來越多的研究亦顯示放射線可以通過作用腫瘤間質(zhì)微環(huán)境影響腫瘤發(fā)生發(fā)展，由此豐富了放射線誘發(fā)腫瘤的證據(jù)。近

2、幾年來肝癌衍生生長因子（Hepatoma-derived growth factor，HDGF）引起了學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注，它既是具有促成纖維細(xì)胞有絲分裂活性的酸性多肽，也與多種腫瘤差的預(yù)后密切相關(guān);同時(shí)其表達(dá)變化與多種腫瘤的轉(zhuǎn)化、凋亡、血管生成以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。HDGF與ESCC患者的放療敏感性以及腫瘤復(fù)發(fā)亦有緊密聯(lián)系。CAFs與腫瘤轉(zhuǎn)移的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)聯(lián)，包括可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchyma

3、l transition，EMT)過程，而大量研究表明EMT可以賦予細(xì)胞遷移、侵襲能力以及誘導(dǎo)干細(xì)胞特性。并且已有多篇文獻(xiàn)證明間質(zhì)成纖維細(xì)胞可以通過EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。與此同時(shí)，最近越來越多的研究表明γ射線源照射成纖維細(xì)胞可以通過腫瘤間質(zhì)相互作用促進(jìn)腫瘤發(fā)生以及侵襲生長。而X射線源照射成纖維細(xì)胞是否促進(jìn)ESCC侵襲轉(zhuǎn)移及其機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。
　　目的：①旨在研究X射線對間質(zhì)成纖維細(xì)胞的作用以及照射后CAFs對ESC

4、C細(xì)胞的影響。②探討在放射線對ESCC與間質(zhì)成纖維細(xì)胞相互作用中的EMT相關(guān)蛋白以及HDGF表達(dá)變化。
　　方法：⑴分離及培養(yǎng)原代CAFs和正常成纖維細(xì)胞(Normal Fibroblasts，NFs)來研究ESCC腫瘤微環(huán)境內(nèi)的間質(zhì)成纖維細(xì)胞特點(diǎn)。為了證明CAFs沒有其他細(xì)胞成分混雜及其純度，利用成纖維細(xì)胞標(biāo)記蛋白纖連蛋白(fibronectin)區(qū)分成纖維細(xì)胞與ESCC細(xì)胞。Western blotting驗(yàn)證原代成纖維細(xì)胞高

5、表達(dá)a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)和不表達(dá)E-鈣粘蛋白(E-cadherin)，體現(xiàn)原代成纖維細(xì)胞的細(xì)胞特性。⑵在室溫條件下，用X射線源以不同劑量照射原代成纖維細(xì)胞，劑量率為400cGy/min。照射后收集條件培養(yǎng)液留待后續(xù)培養(yǎng)ESCC細(xì)胞試驗(yàn)用。⑶采用侵襲實(shí)驗(yàn)檢測與照射后(4Gy和8Gy)或未照射成纖維細(xì)胞(NFs和CAFs)共培養(yǎng)的ESCC細(xì)胞的侵襲能力。⑷采用Scattering實(shí)驗(yàn)檢測照射后成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)液對ESCC細(xì)胞

6、的Scattering能力的影響。⑸ESCC細(xì)胞和4Gy照射后成纖維細(xì)胞或未照射成纖維細(xì)胞均勻混合后種植于裸鼠右背側(cè)皮下，每組六只。每3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小一次并記錄，腫瘤體積計(jì)算公式為:腫瘤體積(V)=（長徑×寬徑2）/2。⑹為了研究照射后成纖維細(xì)胞促進(jìn)ESCC細(xì)胞的遷移及侵襲與EMT有關(guān)，western blotting檢測照射后成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液和未照射成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)的ESCC細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cad

7、herin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物波紋蛋白(vimentin)表達(dá)情況。并用免疫組化檢測β-鏈蛋白(β-catenin)在照射組裸鼠移植瘤內(nèi)的表達(dá)變化，未照射組為對照組。⑺為探討HDGF在放射線照射成纖維細(xì)胞促進(jìn)ESCC細(xì)胞遷移與侵襲中的作用，采用western blotting檢測照射后成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液和未照射成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)的ESCC細(xì)胞中HDGF表達(dá)情況。并用免疫組化檢測HDGF在照射組裸鼠移植瘤內(nèi)的表達(dá)變化，未照射組

8、為對照組。
　　結(jié)果：①從ESCC組織分離及培養(yǎng)的原代成纖維細(xì)胞保持成纖維細(xì)胞特性。用于本實(shí)驗(yàn)的所有成纖維細(xì)胞均為10代以內(nèi)并表現(xiàn)為梭形細(xì)胞形態(tài)。3代以后的成纖維細(xì)胞E-cadherin未見表達(dá)，表明早期代數(shù)的成纖維細(xì)胞保持成纖維細(xì)胞特性。②由于上皮細(xì)胞EMT的時(shí)候Scattering能力會有所增強(qiáng)，具體表現(xiàn)為細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附作用消失并獲得較高活性的間質(zhì)細(xì)胞表型，Scattering實(shí)驗(yàn)已被用于研究細(xì)胞的EMT和檢測細(xì)胞遷移誘

9、導(dǎo)能力。照射后成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的Scattering能力并呈劑量依賴性。③研究表明ESCC細(xì)胞與未照射成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)侵襲能力提高，當(dāng)其與照射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)其侵襲能力會得到進(jìn)一步的增強(qiáng)。④結(jié)果顯示照射組中ESCC細(xì)胞E-cadherin呈劑量依賴性降低，vimentin隨劑量依賴性升高并在所有組中高表達(dá)。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)表明β-catenin在照射組中都表達(dá)升高，免疫組化結(jié)果顯示其在照射組腫瘤組織中的細(xì)胞核高表達(dá)及核

10、轉(zhuǎn)位。⑤照射后成纖維細(xì)胞促進(jìn)ESCC生長，特別是在Eca-9706腫瘤細(xì)胞組中。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)表明照射后成纖維細(xì)胞增強(qiáng)照射組中腫瘤細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中HDGF的表達(dá)。值得注意的是，與間質(zhì)成纖維細(xì)胞相鄰的腫瘤細(xì)胞HDGF在細(xì)胞核中有相對更高的表達(dá)，顯示成纖維細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)。
　　結(jié)論：⑴照射后CAFs促進(jìn)ESCC細(xì)胞侵襲及EMT，增強(qiáng)其Scattering能力。⑵照射后成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞β-catenin核轉(zhuǎn)位。⑶照射后成纖維