轉(zhuǎn)多基因庫安托楊生態(tài)安全性評價及非預(yù)期效應(yīng)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)可以從基因水平上改良林木的目的性狀，克服傳統(tǒng)技術(shù)難以解決的問題。作為模式樹種，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，加快了楊樹良種選育過程，通過基因工程手段已獲得了耐鹽、抗病蟲、抗除草劑、降低木質(zhì)素含量和增加生長量等轉(zhuǎn)基因楊樹。伴隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的推廣，轉(zhuǎn)基因安全問題逐漸顯露出來。因此，轉(zhuǎn)基因植物在實際推廣之前必須進(jìn)行安全性評價。目前，關(guān)于轉(zhuǎn)基因生物安全的研究，在轉(zhuǎn)基因作物方面研究較多，而對轉(zhuǎn)基因林木的研究還很少，研究內(nèi)容也集中在對轉(zhuǎn)基因林木土

2、壤微生物方面，但研究方法多使用傳統(tǒng)的稀釋平板培養(yǎng)計數(shù)法。轉(zhuǎn)基因植物除了可能會對周圍生態(tài)環(huán)境和其它植物產(chǎn)生影響，外源基因在導(dǎo)入植物基因組以后，會改變原有的正常序列，使得自身的代謝過程發(fā)生改變，可能會產(chǎn)生一些非預(yù)期的效應(yīng)。本研究以成齡期（8年生）轉(zhuǎn)多基因庫安托楊(P.× euramericana‘Guariento’）（包含5個外源基因:Vgb基因，編碼好氧透明顫菌血紅蛋白;SacB基因，編碼果聚糖蔗糖酶，參與枯草芽孢桿菌果聚糖的生物合成;

3、BtCry3A，編碼來自鞘翅目蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素;OC-I，是一種抗蟲基因，編碼水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑;JERF36，番茄基因編碼茉莉酮酸/乙烯響應(yīng)因子蛋白）及未轉(zhuǎn)基因庫安托楊為試驗材料，采用Biolog-ECO生態(tài)板和細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)測序的方法研究了轉(zhuǎn)基因林地土壤微生物的碳代謝能力、土壤細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)多樣性;采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法研究了轉(zhuǎn)基因?qū)顦涞拇x物以及木材的性質(zhì)影響。論文的主要

4、研究結(jié)論如下:
　　1.外源基因沒有出現(xiàn)水平轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。使用外源基因Vgb、SacB、BtCry3A+OC-I和JERF36的特異性引物，對試驗林內(nèi)根際土壤微生物DNA和其它多種林下植物的總DNA進(jìn)行了PCR檢測，電泳結(jié)果顯示，所有DNA樣品中均未出現(xiàn)目的基因片段，說明本試驗林地內(nèi)轉(zhuǎn)基因楊樹的外源基因在8年內(nèi)沒有發(fā)生向根際土壤微生物和其它植物水平轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。
　　2.轉(zhuǎn)基因楊樹對土壤微生物數(shù)量和碳代謝能力沒有明顯影響。以5個

5、轉(zhuǎn)基因無性系、1個非轉(zhuǎn)基因無性系和1個未耕作土壤對照編號為實驗材料。使用稀釋平板培養(yǎng)法研究了轉(zhuǎn)基因楊樹的非根際土壤中三種微生物的數(shù)量（細(xì)菌、真菌和放線菌），結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因楊樹和非轉(zhuǎn)基因楊樹的非根際土壤巾可培養(yǎng)的細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量在楊樹的不同生長期是會出現(xiàn)一定的變化，但是這種變化沒有明顯的規(guī)律。應(yīng)用Biolog方法研究轉(zhuǎn)基因楊樹種植對其根際土壤微生物群落功能多樣性的影響，通過對土壤微生物單一碳源利用水平進(jìn)行比較分析，與非轉(zhuǎn)基因楊樹相

6、比轉(zhuǎn)基因楊樹的栽植對根際土壤微生物群落碳源利用能力、豐富度指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)和均勻度指數(shù)的變化影響不明顯;碳源利用多樣性主成分分析表明，無植物種植與其它無性系根際之間分布區(qū)域存在明顯差異，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因之間分布不明顯，說明轉(zhuǎn)多基因庫安托楊對土壤微生物系統(tǒng)沒有明顯的影響。
　　3.轉(zhuǎn)多基因楊樹對根際土壤細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)多樣性沒有影響。本研究使用測序的方法來分析兩個轉(zhuǎn)基因楊樹無性系(D5-20和D5-21)，一個非轉(zhuǎn)基因無性系(D5

7、-0)和未耕作土壤(CK)的根際土壤細(xì)菌的16S rDNA的V4區(qū)域，來判定土壤微生物多樣性和群落的結(jié)構(gòu)組成。通過過濾去掉干擾數(shù)據(jù)，仍然有468133條屬于細(xì)菌的序列存在。在所有的樣本中共有10優(yōu)勢類群（所含序列＞1％）。551個菌屬中有241個(含量占比例的97.33％)種菌屬在所有樣品中都存在。維恩圖顯示，1926個OUT被所有樣本共享。在栽植楊樹（轉(zhuǎn)基因楊樹和非轉(zhuǎn)基因楊樹）的根際土壤微生物中我們發(fā)現(xiàn)綠彎菌門的含量顯著降低。最終結(jié)果

8、，我們通過比較轉(zhuǎn)基因楊樹、非轉(zhuǎn)基因楊樹和未耕作土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，這表明這種遺傳修飾對根際細(xì)菌群落的幾乎沒有影響。
　　4.轉(zhuǎn)基因楊樹木材的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)出現(xiàn)廣泛變異。對5個轉(zhuǎn)基因無性系和1個非轉(zhuǎn)基因無性系進(jìn)行株高、胸徑、木材的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)比較分析。而且轉(zhuǎn)基因無性系之間及與對照間均存在差異，與未轉(zhuǎn)基因楊樹相比轉(zhuǎn)基因楊樹的株高、綜纖維素和纖維素含量均增加，株高最高增加4.57％，綜纖維素最高增加

9、6.21％，纖維素含量最高增加5.01％;總木素和酸溶木素含量均下降，總木素含量最高降低17.06％，酸溶木素含量最高降低13.99％;而胸徑、纖維長、纖維寬、微纖絲角和酸不溶木素含量的變化則有增有減。所以說外源基因的導(dǎo)入引起了非靶目標(biāo)材性性狀的廣泛變異。
　　5.轉(zhuǎn)基因楊樹木材代謝物的含量發(fā)生變化，但是組分卻沒有發(fā)生改變。使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對轉(zhuǎn)基因楊樹木材代謝組進(jìn)行非靶標(biāo)無偏向性的檢測，在2個轉(zhuǎn)基因無

10、性系(D5-20、D5-21)和1個非轉(zhuǎn)基因無性系(D5-0)的代謝物中，我們共檢測出197種代謝物，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入基因以后沒有出現(xiàn)代謝物種類的增加和缺失。但在進(jìn)行代謝物含量的對比時，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因無性系(D5-20)有52種代謝物在含量上與非轉(zhuǎn)基因無性系(D5-0)出現(xiàn)顯著差異，另一個轉(zhuǎn)基因無性系(D5-21)有83種代謝物在含量上與非轉(zhuǎn)基因無性系(D5-0)出現(xiàn)顯著差異。將兩個轉(zhuǎn)基因無性系進(jìn)行對比，卻只有13種在含量上出現(xiàn)顯著差異。PCA分析