CD320和RanBP9在山羊精原干細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法（sperm-mediated gene transfer,SMGT）是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的有效途徑，具有簡便、高效特點(diǎn)，但機(jī)制至今不明確。我們前期研究證明CD4分子在山羊精子內(nèi)化外源DNA的過程中起主要作用，并利用酵母雙雜交系統(tǒng)，篩選與CD4相互作用的新型侯選分子—CD320和RanBP9，且通過免疫共沉淀方法初步驗(yàn)證了CD4與CD320和RanBP9具有相互作用，同時證明CD320和RanBP9在睪丸中的表達(dá)水平較高。

2、但這兩個分子在精子轉(zhuǎn)染外源DNA的作用研究仍是空白。由于動物精子是精子細(xì)胞經(jīng)過變態(tài)、高度分化形成的一類細(xì)胞，不具有分裂增殖的能力，不利于基因功能的研究。因此，我們將研究對象轉(zhuǎn)向了與精子有密切關(guān)系的精原干細(xì)胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）。SSCs是性別分化后，精子發(fā)生的最初細(xì)胞形式，是精子生成和雄性生育能力的基礎(chǔ)，具有自我更新維持生殖細(xì)胞數(shù)量恒定和定向分化產(chǎn)生精母細(xì)胞的潛能，也是成年雄性動物體內(nèi)唯一能將

3、遺傳信息傳遞給下一代的成體干細(xì)胞。SSCs可塑性較強(qiáng)，在體外可重編程為胚胎干細(xì)胞樣多能干細(xì)胞，也能被誘導(dǎo)分化為精子樣細(xì)胞，因此成為基因工程和細(xì)胞工程的理想種子細(xì)胞。目前小鼠、人、牛等動物的SSCs體外培養(yǎng)研究已相對成熟，但是有關(guān)山羊SSCs的報道較少。
　　本研究首先對山羊SSCs進(jìn)行分離、純化及鑒定，獲得體外培養(yǎng)的山羊SSCs，然后分別轉(zhuǎn)染外源CD320和RanBP9，從細(xì)胞水平探索CD320和RanBP9在山羊SSCs中的表達(dá)

4、情況，為進(jìn)一步研究CD320和RanBP9在精子轉(zhuǎn)染外源DNA的作用奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.山羊SSCs的分離、純化及鑒定。采集4月齡山羊睪丸，采用兩步酶消化法分離睪丸細(xì)胞，差速貼壁法純化獲得單細(xì)胞懸液，純化后的精原細(xì)胞用無飼養(yǎng)層、1％血清同時添加GDNF、LIF和bFGF的培養(yǎng)液培養(yǎng)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，且運(yùn)用堿性磷酸酶、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和RT-PCR3種方法對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，

5、細(xì)胞培養(yǎng)到14 d時已經(jīng)形成了明顯的細(xì)胞克隆，傳代培養(yǎng)后仍能形成細(xì)胞克隆，且克隆周圍的雜細(xì)胞減少，細(xì)胞克隆傳至第二代時，細(xì)胞克隆減少，梭型細(xì)胞增多。堿性磷酸酶染色顯示不同時間段的細(xì)胞著色深淺不一樣，而體細(xì)胞不著色；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞克隆表達(dá)SSCs標(biāo)記PGP9.5、PLZF，而體細(xì)胞不表達(dá)；RT-PCR證實(shí)細(xì)胞克隆中SSCs的特異性標(biāo)記基因CD29、CD49f、PLZF、OCT-4和THY1的表達(dá)水平明顯比體細(xì)胞高，而細(xì)胞凋亡基因

6、P21在SSCs中的表達(dá)明顯比體細(xì)胞低。明確了培養(yǎng)的細(xì)胞克隆為SSCs克隆，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　2.CD320在山羊SSCs中的表達(dá)情況。設(shè)計引物，運(yùn)用實(shí)時熒光定量 PCR檢測CD320基因在山羊SSCs中的表達(dá)水平，并構(gòu)建山羊CD320基因的表達(dá)載體，檢測CD320在293T細(xì)胞中的定位及山羊SSCs中的轉(zhuǎn)染情況。RT-PCR顯示CD320基因在山羊SSCs中的表達(dá)水平明顯高于體細(xì)胞，差異極顯著；細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，CD320

7、在293T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，在山羊SSCs的細(xì)胞克隆中表達(dá)，但是在SSCs傳代培養(yǎng)后，并未見到CD320仍有表達(dá)。
　　3.RanBP9在山羊SSCs中的表達(dá)情況。設(shè)計引物，運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR檢測RanBP9基因在山羊SSCs中的表達(dá)水平，并構(gòu)建山羊RanBP9基因的表達(dá)載體，檢測RanBP9在293T細(xì)胞中的定位及在山羊SSCs中的轉(zhuǎn)染情況。RT-PCR顯示RanBP9基因在山羊SSCs中的表達(dá)水平高于體細(xì)胞，但差異不顯著