RPL9基因的原核表達和脂肪細胞中的表達.pdf

1、近年來，有關豬脂肪沉積的研究備受關注，豬脂肪組織的形成從細胞生物學角度分析是脂肪細胞增殖、分化和凋亡共同作用的結果。因此，脂肪細胞分化的研究對豬的機體脂肪沉積具有重要的理論和實踐意義。借鑒實驗室前期實驗結果，在我國地方豬種太湖豬與國外瘦肉型豬種長白豬脂肪組織的基因差異表達分析中，太湖豬核糖體蛋白 L9（RPL9）基因的表達量相比于長白豬RPL9基因的表達量上調了16.1倍，這說明RPL9基因可能對脂肪細胞分化的調控和脂肪酸代謝的平衡產生

2、影響,進而影響脂肪沉積。因此,對RPL9進行深入研究,探尋其與脂肪分化的關系，既為肉用家畜肉質改良提供參考依據(jù)，又為進一步研究豬 RPL9在動物育種中的作用奠定基礎。本實驗主要研究內容如下：
　?。?）豬RPL9基因的克隆
　　參照 Genebank注冊的豬 RPL9基因序列（NM_001243481）設計特異性引物，運用PCR技術，以豬肝臟組織cDNA為模板，擴增579bp的豬RPL9基因全長編碼序列，擴增產物與pMD18

3、-T連接，經轉化、篩選、測序，結果表明成功構建重組質粒豬Top10-pMD18-T-RPL9，該序列與NM_001243481登陸的序列同源性為100％。
　?。?）豬RPL9基因的原核表達以及純化
　　豬Top10-pMD18-T-RPL9經雙酶切后與表達載體pET30a連接，隨后轉化表達菌株BL21，經鑒定表明成功構建重組質粒 BL21-pET30a-RPL9，隨后對重組質粒BL21-pET30a-RPL9進行誘導表達，

4、表達產物經鎳離子柱純化，初步獲得純化的目的蛋白。
　?。?）豬RPL9蛋白的生物信息學分析
　　利用生物信息學工具NCBI、ExPASy、SWISS-MODEL等對RPL9進行理化性質、跨膜區(qū)、二級結構、疏水性、三級結構、翻譯后修飾、進化樹7個方面的分析，結果表明RPL9蛋白分子量為21863.4，等電點為9.96，為非跨膜親水性蛋白，成功預測其二、三級結構并繪制出其進化樹。
　?。?）鼠RPL9基因的克隆
　　

5、參照Genebank注冊的鼠RPL9基因序列（NM_011292.2）設計特異性引物，運用PCR技術，以鼠肝臟組織cDNA為模板，擴增579bp的鼠RPL9基因全長編碼序列，擴增產物與pMD18-T連接，經轉化、篩選、測序，結果表明成功構建重組質粒鼠 Top10-pMD18-T-RPL9，該序列與NM_011292.2登陸的序列同源性為98.45％。
　　（5）鼠RPL9基因在脂肪細胞中的表達
　　鼠Top10-pMD18-