香菇多糖增強吉西他濱抑制膀胱癌的療效分析及其影響荷瘤小鼠化療前后免疫應答功能的作用研究.pdf

1、目的:
　　膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在世界范圍內，膀胱癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第十一位，其形成過程復雜，多種基因參與其中，可分為非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)、肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)和轉移性膀胱癌，其中20～30％的新發(fā)病例是MIBC[1]。MIBC的治療以根治性膀胱切除及盆腔淋巴結清掃為主，術后復發(fā)率高達30～45％，5年生存率為45～66％[2]。微轉移灶是局部治療MIBC失敗的主要原因之一;約50％新診斷的M

2、IBC患者已發(fā)生潛在的局部或遠處轉移，MIBC僅手術治療效果有時并不理想，以及部分患者不能通過手術完全切除病灶，臨床往往會輔以放、化療為主的治療手段。輔助化療可以使病理分期明確、有轉移證據(jù)的患者受益于系統(tǒng)化療，減少局部復發(fā)或遠處轉移復發(fā)的可能性。因此，輔助化療更早地被醫(yī)生和患者接受，因為疾病相關病死率越高的患者從輔助化療受益的程度也就越高。吉西他濱(Gemcitabine，GEM)是一種脫氧胞苷類似物.屬嘧啶類，是細胞周期特異性抗腫瘤代

3、謝類藥物，主要作用于S期細胞，抑制DNA合成，并可阻止細胞由G1期進入S期。GEM在全身多系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)揮了巨大的作用，已成為非小細胞肺癌、胰腺癌和肌層浸潤性膀胱癌術后化療的一線用藥[3]。臨床治療中GEM常與其他藥物聯(lián)用，發(fā)展出一系列的聯(lián)合治療方案都收到了較好的效果。值得關注的是，化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，難免會使正常細胞收到一定的損害，產(chǎn)生相應的毒副反應，如骨髓抑制，免疫功能下降等等?；熕幬飵淼母鞣N不良反應也影響了化療的持

4、續(xù)實施，同時患者的年齡、腎功能和經(jīng)濟狀況也是影響接受化療的原因。因此，在尋求殺傷癌細胞的同時，又可以增加或者重建免疫功能，成為了臨床研究的新方向。
　　現(xiàn)代研究證實，惡性腫瘤的患者往往存在不同程度的免疫功能缺陷[4,5]。理論上，人體強大的免疫系統(tǒng)通過細胞免疫機制產(chǎn)生排斥反應，使突變細胞在未形成腫瘤之前即被清除，實際上許多腫瘤仍可逃避宿主的免疫攻擊而繼續(xù)生長，主要原因是由于患者全身免疫和腫瘤部免疫微環(huán)境的變化，造成腫瘤的免疫逃逸。

5、腫瘤與免疫系統(tǒng)之間存在復雜的相互作用[6]，表現(xiàn)在:①免疫系統(tǒng)通過免疫應答抑制腫瘤生長和進展;②免疫系統(tǒng)通過誘導的炎癥反應反而促進腫瘤生長、存活和血管形成;③腫瘤利用免疫調節(jié)機制形成免疫抑制微環(huán)境，不僅抑制宿主免疫應答，而且形成了一道阻斷抗腫瘤性免疫治療的屏障。機體的抗腫瘤免疫效應機制包括細胞免疫和體液免疫兩個方面[7]，T細胞主導細胞免疫功能，是機體免疫對抗腫瘤的主力，NK細胞則具有非特異性抗腫瘤作用，二者在腫瘤細胞免疫中的地位越來越

6、受到人們的重視;B細胞介導的體液免疫在抗腫瘤免疫中起協(xié)同作用。有證據(jù)顯示腫瘤可以導致外周T細胞功能嚴重受損，降低循環(huán)T細胞的反應性從而導致機體免疫抑制[8]。在膀胱癌動物模型中，外周血中T淋巴細胞數(shù)量減少，尤其是在腫瘤組織T淋巴細胞數(shù)目減少更加明顯，也是惡性腫瘤免疫逃逸的主要機制之一[9]。所以研究膀胱癌免疫功能抑制機制，在應用化療藥物有效治療的同時，找到其免疫功能恢復的方法，對膀胱癌的預防和治療有重要理論及臨床意義。香菇多糖(Lent

7、inan)是從優(yōu)質香菇子實體中提取的有效活性成分，具有抗腫瘤的作用，進入人體后誘導T細胞產(chǎn)生一種具有免疫活性的細胞因子，增強體內自然殺傷細胞的活性，對腫瘤細胞起到防御和殺傷的作用[1]。
　　目前，香菇多糖主要作為一種免疫輔助藥物應用于臨床，能配合其他抗腫瘤藥物有效促進T、B淋巴細胞增殖，并激發(fā)自然殺傷細胞活性，部分研究發(fā)現(xiàn)其本身對實體瘤也有一定的抑制作用[11]，目前針對其抑制膀胱癌的作用鮮有研究，尤其是與吉西他濱聯(lián)合應用抑制膀

8、胱癌的研究尚無報道。本研究分別或聯(lián)合應用化療藥物（吉西他濱）和免疫調節(jié)劑（香菇多糖）作用于膀胱癌細胞系T24，觀察不同給藥時序所產(chǎn)生的不同作用效果，進一步明確香菇多糖在體外實驗中對T24細胞增殖和凋亡的影響作用，同時明確應用香菇多糖對吉西他濱抑癌效果起到增效、增敏的作用。另外，通過建立MB49鼠膀胱癌細胞C57BL/6小鼠模型，檢測免疫相關細胞因子的分泌及T淋巴細胞分布時相改變從而探討膀胱癌腫瘤免疫抑制發(fā)生的具體機制;檢測膀胱癌小鼠經(jīng)化

9、療治療前后免疫功能變化情況，以及應用香菇多糖對免疫應答功能的改善情況。通過本課題的研究可了解香菇多糖增強吉西他濱抑制膀胱癌的作用;膀胱癌免疫抑制的分子機制，應用吉西他濱對免疫功能的影響以及應用香菇多糖對接受化療的荷瘤小鼠免疫功能的影響及其作用機制，為膀胱癌的預防及治療提供理論基礎和新的思路。
　　材料和方法:
　　體外培養(yǎng)人膀胱癌細胞系T-24，采用MTT法檢測不同濃度和作用時間的吉西他濱、香菇多糖單獨對細胞的增殖抑制效應，

10、繪制濃度-生長抑制率曲線，計算半數(shù)抑制濃度IC50; MTT法檢測吉西他濱聯(lián)合香菇多糖不同給藥時序對T-24細胞的增殖抑制作用;Annexin-V-FITC/PI雙標記染色法檢測各實驗組對細胞凋亡的影響及PI單染法檢測各組對細胞周期的影響;Western blot法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Survivin的表達變化。構建Mb49鼠膀胱癌細胞C57BL/6小鼠皮下成瘤模型，分別應用單藥或聯(lián)合用藥模式，記錄治療后各組小鼠成瘤情況，繪制生

11、長曲線、解剖小鼠、測量瘤重、取出脾臟及淋巴結，并通過細胞流式染色檢測不同組別小鼠脾臟及脾周淋巴結CD3+ CD8+T細胞、CD3+ CD4+T細胞數(shù)量百分比;進一步檢測抗原提呈細胞包括CD11B+ F4/80巨噬細胞、CD11b+ Gr-1單核髓系抑制細胞(MDSCs)、樹突狀細胞兩個亞群CD11c+TRL4+ DC及CD11c+TRL9+ DC數(shù)量;以及調節(jié)性T細胞(Treg) CD4+ CD25+ Foxp3+、CD152+T細胞數(shù)

12、量變化，動態(tài)觀察C57BL/6小鼠Th1免疫應答的差異;通過ELISA檢測培養(yǎng)上清IFN-γ、 IL-2、IL-10、TGF-β等細胞因子差異，進一步驗證香菇多糖協(xié)同吉西他濱抑制膀胱癌的作用，應用吉西他濱化療對免疫功能的影響，以及應用香菇多糖后免疫功能的變化和其可能的作用機制。實驗數(shù)據(jù)采用-x±s表示，實驗原始數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，組內比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，兩變量相關分析

13、采用Pearson相關分析，P＜0.05差異具有顯著意義，P＜0.01差異具有極顯著意義。
　　結果:
　　吉西他濱單獨用藥組對T-24細胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性;香菇多糖單獨用藥組在其濃度＜80ug/ml時對T-24細胞的增殖抑制作用亦呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，但當香菇多糖濃度達到80ug/ml時，T-24細胞對其產(chǎn)生耐藥性，增加香菇多糖的藥物濃度但抑制率無明顯改變(P＞0.05)。MTT結果提示兩藥聯(lián)合時對

14、T-24細胞的抑制作用明顯強于單一用藥，結果差異明顯，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);且最佳給藥時序為兩者同時給藥。Annexin-V-FITC/PI雙標記染色法結果也提示兩藥同時處理T-24細胞時的凋亡率高于其他處理組(P＜0.01)。PI單染法結果示吉西他濱和香菇多糖單獨用藥組或兩者聯(lián)合用藥組都能使S期細胞比例減少，G1期比例增加(p＜0.05)，其中吉西他濱單藥或香菇多糖單獨用藥作用下停滯于G1期的細胞更多些，處于S期細胞更少些(

15、p＜0.05)，但兩者之間差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。Mb49鼠膀胱癌細胞移植可成功建立C57BL/6小鼠植瘤模型。給予香菇多糖輔助治療后小鼠生存期較單用吉西他濱延長，腫瘤體積和腫瘤重量減小，給予香菇多糖可以大大提高抗腫瘤免疫應答增加CD3+ CD4+T細胞和CD3+ CD8+T細胞數(shù)量，促進IFNγ和IL-2分泌，增加CD11c+ TRL4+ DCs的百分比，還可促進CD11b+F4/80+巨噬細胞活化;香菇多糖的使用還可明顯降

16、低MDSCs數(shù)量，也可降低CD4+ CD25+ Foxp3+調節(jié)性T細胞數(shù)量，抑制IL-10分泌，組間差異明顯，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　體外實驗證實，香菇多糖單獨用藥可以抑制膀胱癌細胞系T24增殖及誘導凋亡，吉西他濱與香菇多糖聯(lián)合作用于人膀胱癌T-24細胞時，香菇多糖對吉西他濱起到增效、增敏的作用，對T-24的抑制增殖和誘導凋亡的作用明顯大于單一用藥，且最佳時機可能是兩種藥物同時作用于T-24細胞。

17、
　　應用香菇多糖后荷瘤小鼠生存期較單用吉西他濱延長，腫瘤體積和腫瘤重量減小，且可以大大提高抗腫瘤免疫應答，增加CD3+ CD4+T細胞和CD3+ CD8+T細胞數(shù)量，促進IFNγ和IL-2分泌，間接達到抗腫瘤的作用;而這這一作用可能是通過DCs活化，尤其是CD11c+ TRL4+ DCs的活化誘導有效的Th1細胞免疫應答而達到的，TLR4是介導MB49荷瘤小鼠DCs活化的重要模式識別受體;另外香菇多糖還可促進CD11b+F4/8