激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)基因相關SNPs及其單體型與長沙漢族人群腦出血的關系研究.pdf

1、研究背景和目的：腦卒中是當今世界公認的三大主要疾病死因之一，腦出血為其中的頭號殺手，對人類生命與健康危害極大。腦出血在腦卒中所占的比例在不同的地域及種族存在差異。國外的流行病學資料表明腦出血在腦卒中所占的比例大約在6.5-19.6％之間。通過近20年的流行病學監(jiān)測，我們發(fā)現(xiàn)1986～2000年長沙市地區(qū)人群腦卒中年平均發(fā)病率為236.6/10萬，其中腦出血的發(fā)病率131.0/10萬，占腦卒中的55.4％，長沙為世界腦出血的高發(fā)區(qū)之一，但

2、該地區(qū)腦出血的原因尚不明確。為此我們進行了一系列的病因學研究。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)長沙地區(qū)腦出血具有家族聚集現(xiàn)象，遺傳因素可能是該地區(qū)腦出血高發(fā)的原因之一。候選基因篩查是目前研究腦出血這類復雜多基因病的主要手段。目前有相當多的證據表明與高血壓及血管重構相關的激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS）代謝通路在小動脈硬化、顱內動脈瘤形成乃至心腦血管疾病的“候選基因”研究中占有相當重要的地位，KKS系統(tǒng)可能

3、在腦出血發(fā)病的病理生理機制中起著重要的作用。但KKS系統(tǒng)相關SNPs和單體型分子標志與有家族聚集現(xiàn)象的腦出血之間的關系研究，目前國內外迄今為止未見報道。本課題首次通過研究不同群體包括正常人群、散發(fā)性腦出血患者，有家族聚集現(xiàn)象的腦出血患者及其家系成員的相關基因，包括激肽原（KNG1）基因、組織型激肽釋放酶（KLK1）基因和血管緊張素轉化酶（ACE）基因的SNPs位點及單體型分子標志分布情況。從而比較不同群體的基因型的差異及其對腦出血的易感

4、性，從分子水平探討腦出血的發(fā)病機理，為預防和治療腦出血提供理論依據。 材料和方法：收集2006年1月至2008年10月在湘雅醫(yī)院神經內科就診的腦出血患者及部分家屬的資料，所有病例均經CT和/或MRI確診（依照第四屆全國腦血管病學術會議診斷標準）；對照組來自湖南省長沙地區(qū)漢族健康體檢人員。對照組成員、腦出血患者及腦出血家系成員均為湖南省長沙地區(qū)漢族人，并簽署知情同意書。所有的研究對象具體分組如下：（1）有家族聚集現(xiàn)象的腦出血家系（

5、cerebral hemorrhage with family history，CHFH）：38個家系共有200人，包括腦出血患者61例，Ⅰ級親屬95例，Ⅱ級親屬23例和健康無血緣關系親屬21例。（2）散發(fā)性腦出血組（sporadic cerebral hemorrhage，SCH）：273例。（3）對照組：140例。病例組與對照組的年齡、性別具可比性。采用多重單堿基延伸SNP分型技術（Multiplex Snapshot）對組織型激肽

6、釋放酶（KLK1）基因rs3212855、rs5515、rs5516和rs5517位點，血管緊張素素轉化酶（ACE）基因rs4291、rs4343位點和激肽原（KNG1）基因rs1656922、rs2304456等相關SNPs位點進行基因分型；采用聚合酶鏈式反應結合瓊脂糖凝膠電泳分析方法檢測血管緊張素轉化酶（ACE）基因第16內含子的I/D多態(tài)位點（rs4646994）。在進一步對基因分型結果的統(tǒng)計分析中，首先在基于人群的病例對照研究中

7、，通過卡方檢驗比較散發(fā)性腦出血組和對照組基因型分布和等位基因頻率的差異，從而確定與疾病關聯(lián)的基因；進一步在以家系為基礎的關聯(lián)研究中，用FBAT軟件進行傳遞不平衡檢驗（TDT），確認與長沙漢族人群腦出血相關的SNPs及單體型分子標志。 結果：1.組織型激肽釋放酶基因（KLK1）rs3212855、rs5515、rs5516和rs5517位點基因分型結果的分析：①在本研究樣本中未能證實rs5515是多態(tài)性位點（所有檢測的樣本均為GG

8、型純合子，未見GA及AA基因型）。②其它三個多態(tài)性位點在散發(fā)性腦出血組和對照組的比較：rs3212855和rs5516位點的基因型和等位基因頻率在兩組間分布無差異（P>0.05）；而散發(fā)性腦出血組rs5517多態(tài)位點基因型分布與對照組比較存在顯著差異（P<0.05），散發(fā)性腦出血組rs5517 A等位基因頻率顯著高于對照組（P<0.05）。③家系關聯(lián)研究：在以家系為基礎的關聯(lián)檢驗（FBAT）中，有兩個多態(tài)性位點顯示等位基因傳遞具有統(tǒng)計學

9、顯著性（rs5516的G： Z=2.422，P=0.015424；rs5517的A：Z=2.963，P=0.003049）。多態(tài)性位點間的連鎖不平衡檢驗顯示三個多態(tài)性位點（rs3212855、rs5516和rs5517）緊密連鎖，在一個單體型塊（haplotype block）中，可以構建三個多態(tài)性位點組成的單體型模式。對三位點組成的單體型傳遞的總體檢驗顯示KLK1基因與腦出血存在關聯(lián)（X2=12.664，自由度=4，P=0.01304

10、2），單個單體型的分析也顯示rs3212855、rs5516、rs5517三位點構成的單體型CGA在患者中過度傳遞，差異有顯著性（Z=2.881，P=0.003969）。 2.激肽原基因（KNG1）rs1656922和rs2304456位點基因分型結果的分析：①散發(fā)性腦出血組和對照組的比較：rs1656922的基因型分布和等位基因頻率在兩組間無差異（P>0.05）；rs2304456的基因型分布和等位基因頻率在兩組間無差異（P>

11、0.05）。②家系關聯(lián)研究：rs1656922和rs2304456兩SNPs位點在以家系為基礎的關聯(lián)檢驗（FBAT）中，顯示等位基因傳遞沒有統(tǒng)計學顯著性（P>0.05）。多態(tài)性位點間的連鎖不平衡檢驗顯示這兩個多態(tài)性位點呈連鎖不平衡，在一個單體型塊（haplotype block）中，可以構建兩個多態(tài)性位點組成的單體型模式。單體型傳遞的總體檢驗及單個單體型的分析均未顯示單體型存在過度傳遞現(xiàn)象（P>0.05）。 3.血管緊張素轉化酶

12、基因（ACE）的rs4291、rs4646994和rs4343位點基因分型結果的分析：①在散發(fā)性腦出血組和對照組的比較：rs4291、rs4646994和rs4343三個多態(tài)性位點的基因型分布和等位基因頻率在兩組間無差異（P>0.05）。②家系關聯(lián)研究：以家系為基礎的關聯(lián)檢驗（FBAT）中，顯示三個多態(tài)性位點的等位基因的傳遞均沒有統(tǒng)計學顯著性（P>0.05）。多態(tài)性位點間的連鎖不平衡檢驗顯示三個多態(tài)性位點（rs4291、rs464699

13、4和rs4343）緊密連鎖，在一個單體型塊（haplotype block）中，可以構建三個多態(tài)性位點組成的單體型模式。單體型傳遞的總體檢驗及單個單體型的分析均未顯示單體型存在過度傳遞現(xiàn)象（P>0.05）。 結論： 1.組織型激肽釋放酶基因（KLK1）的rs5517位點A等位基因及rs3212855、rs5516、rs5517三位點構成的單體型CGA可能與湖南長沙漢族人群腦出血發(fā)病有關。 2.激肽原基因（KNG1