一次性電化學酒精生物傳感器的研究.pdf

1、近年來，隨著交通運輸業(yè)的迅速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，機動車和擁有駕駛執(zhí)照的人員數(shù)量快速增長，交通事故頻繁發(fā)生，其中因駕駛人員飲酒與醉酒造成的交通事故就占20％。 長期以來，由于我國一直沒有檢測酒后（飲酒8小時之內）駕車的國家標準，又沒有一種簡便、快速、準確檢測血酒精濃度的便攜式檢測儀。因此當酒后駕車人員面臨交通警察處罰時，還“理直氣壯”地要法律條例，處罰證據(jù)。 目前血酒精濃度（blood alcohol conce

2、ntration，BAC）測定的主要方法有：呼氣法、分光光度法、氣相色譜法。呼氣法雖然操作簡單、價格低廉，但只能定性，不能準確定量檢測。分光光度法和氣相色譜法均需要血漿或血清樣本，受試者要到醫(yī)院或專業(yè)機構抽取靜脈血，給受試者及交管部門帶來極大不便。綜上所述，呼氣法、分光光度法、氣相色譜法不能滿足簡便、快速定量檢測血酒精濃度的要求。 生物傳感器是分析生物技術的一個重要領域，它是一個典型的多學科交叉產物，結合了生命科學、分析化學、物

3、理學和信息科學及其相關技術，能夠對所需要檢測的物質進行快速分析和追蹤。經過30多年的發(fā)展，已經成為一個涉及內容廣泛、多學科介入和交叉、充滿創(chuàng)新活力的領域。生物傳感器由于其高選擇性、高靈敏度，已經被廣泛地應用于臨床診斷、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測等領域。 以酶作為分子識別器件的電化學生物傳感器稱為酶電極。酶電極是由一個固定化的酶敏感膜和與之密切結合的電極組成的換能系統(tǒng)，它把固化酶和電極結合在一起。要使酶作為電化學生物傳感器的敏感膜使用，必

4、須將酶固定在電極表面，即在電極表面覆蓋一層敏感膜。在固定過程中，既要保持酶本身固有的特性，又要避免自由酶應用上的缺陷。因此酶的固定化技術決定著酶電極的穩(wěn)定性、選擇性和靈敏度等主要性能。 絲網印刷是印刷業(yè)的一項傳統(tǒng)工藝，有悠久的歷史。20世紀60年代以后廣泛用于電子工業(yè)生產，作為制作電路板的主要工序。1981年，一項專利文獻報道將絲網印刷技術用于厚膜電化學傳感器的制作。絲網印刷技術主要優(yōu)點包括：①可以在表面印制各種圖案，設計十分靈

5、活；②印刷過程容易實現(xiàn)自動化；③重現(xiàn)性好；④適用于各種材質；⑤成本低廉，因此能夠大批量生產重現(xiàn)性好的生物傳感器。由于傳感器成本很低，可以一次性使用，即所謂“用過即扔”，對臨床檢驗非常方便。 本研究將電化學酶傳感器、納米技術、絲網印刷技術、臨床檢驗分析技術結合起來制備一次性酒精生物傳感器，探討了pH、緩沖液、溫度、干擾物等對傳感器響應電流的影響，并用于實際樣品酒精濃度檢測，表現(xiàn)出了良好的特異性、敏感性、重復性、穩(wěn)定性，而且響應時間

6、快、線性范圍寬，為醫(yī)學實驗室和交通執(zhí)法部門提供了一種快速檢測血酒精濃度的參考。 本研究主要分為以下兩個部分： 1.基于交聯(lián)法固定酶的絲網印刷電極（screen-printed electrode，SPE）酒精生物傳感器的制備。方法：1）絲網印刷電極的制備：在0.2mm厚的聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）薄膜上首先印刷一層導電銀膜，再用碳漿印刷直徑為3mm的圓盤作為工作電極，然后用PVC油墨印刷在導

7、電銀膜上作為絕緣層。2）Nafion-MB修飾電極的制備：絲網印刷電極在室溫下依次用乙醇和超純水超聲清洗10min，然后在空氣中晾干。將5％（w/w）Nafion-117溶液用無水乙醇稀釋到1％（W/W），然后吸取5μL1％的Nafion-乙醇溶液滴加在絲網印刷電極的工作區(qū)域，在空氣中干燥，待電極表面干燥后形成一層Nafion膜。然后將Nafion修飾的絲網印刷電極置于含1mmol/L麥爾多拉藍（Meldola's blue，MB）的磷

8、酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（0.1mol/L，pH8.0）中用循環(huán)伏安法以50mV/s的掃描速度進行循環(huán)伏安掃描，使MB通過離子交換固定到Nafion膜中。3）酒精生物傳感器的制備：把4mg乙醇脫氫酶（Alcohol Dehydrogenase，ADH）、5mg NAD+（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）、10mg牛血清白蛋白（bovine serum a

9、lbumin，BSA）溶于200μL磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH8.0）中，再加入20μL2.5％戊二醛溶液充分混合；再吸取5μL此溶液滴加到已制備好的Nafion-MB修飾絲網印刷碳電極（screen-printed carbon electrode，SPCE）工作區(qū)域，在空氣中干燥，溶劑蒸發(fā)后形成一層酶膜，制成酒精生物傳感器。制成的酒精生物傳感器在使用前被置于4℃冰箱保存。結果：所有測試均在電化學工作站中三電極系統(tǒng)下完成，飽

10、和甘汞電極（saturated calomelelectrode，SCE）作為參比電極，鉑絲作為對電極，Nafion-MB-酶修飾絲網印刷電極作為工作電極。該傳感器在25℃時，以-0.17V（vs.SCE）作為工作電位，在pH為8.0的磷酸鹽緩沖液中響應電流達到最大。傳感器檢出限為1.1×10-5mol/L，達到95％穩(wěn)態(tài)響應時間不超過30S。用同一支生物傳感器對含1mmol/L的酒精的磷酸鹽緩沖液（pH8.0）重復測定10次，相對標準

11、偏差（relative standard deviation，RSD）為3.6％。在5個批次印制的絲網印刷電極中隨機抽樣5個電極制成酒精生物傳感器，分別對含1mmol/L的酒精的磷酸鹽緩沖液（pH8.0）重復測定3次取其平均值，相對標準偏差為4.3％。酒精生物傳感器于4℃冰箱放置10、20、30天后，對相同濃度的底物響應電流分別減少了3.7％、5.2％、8.4％。甲醇、糖、乳酸、抗壞血酸等均不會影響生物傳感器對酒精的響應。結論：該酒精生

12、物傳感器可以快速檢測酒精濃度，表現(xiàn)出良好的特異性、重復性、準確性、穩(wěn)定性和抗干擾能力，可以為實驗室檢測酒精濃度提供一個參考。 2.基于Nafion和納米金（gold nanoparticles，GNPs）固定酶的絲網印刷電極酒精生物傳感器的制備。方法：1）納米金的制備：取一定量的氯金酸溶液加熱至沸，迅速加入檸檬酸鈉溶液還原。所制備的溶液置于棕色瓶內于4℃保存。納米金溶膠的顏色為亮紅色，其粒徑可用透射電子顯微鏡測試約為20nm。2

13、）MB修飾的絲網印刷電極的制備：用聚酯作為生物傳感器的基質材料，在聚酯上首先印刷一層導電銀膜，再用混合2％（w/w）MB的碳漿印刷直徑為3mm的圓盤作為工作電極，然后印刷UV膠作為絕緣層。銀漿和碳漿印刷后，電極在40℃干燥2h以除去所應用油墨中的水分。UV膠印刷后需進行UV固化。3）酒精生物傳感器的制備：MB修飾的絲網印刷電極在室溫下依次用無水乙醇和超純水超聲清洗10min，然后在空氣中晾干。把4mg ADH、5mg NAD+溶于200

14、μL磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH8.0）中配成酶液。再把100μL酶液和100μL5％（w/w）Nafion溶液充分混合。然后100μL納米金溶液被加入以上溶液并充分混合。接著10μL混合溶液被滴加到MB修飾絲網印刷電極的工作區(qū)域，在空氣中干燥，溶劑蒸發(fā)后形成一層酶膜，制成酒精生物傳感器。制成的酒精生物傳感器在使用前被置于4℃冰箱保存。結果：所有測試均在電化學工作站中三電極系統(tǒng)下完成，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲作為對電極，M

15、B-酶-Nafion-GNPs修飾絲網印刷電極作為工作電極。該傳感器在25℃時，以0.0V（vs.SCE）作為工作電位，在pH為8.0的磷酸鹽緩沖液中響應電流達到最大。傳感器檢出限為1.6×10-5mo/L，檢測上限達到了8mmol/L，達到95％穩(wěn)態(tài)響應時間不超過40S。用同一個生物傳感器在1天內對兩個不同的酒精濃度（1和5mmol/L）分別連續(xù)檢測10次，相對標準偏差為5.49和1.44％。從10批絲網印刷電極中隨機抽取10支電極制

16、成酒精生物傳感器，然后用這10支不同的生物傳感器分別對兩個不同的酒精濃度（1和5mmol/L）進行檢測，相對標準偏差為6.98和2.49％。酒精生物傳感器于4℃冰箱放置10、20、30天后，對1mmol/L酒精響應電流分別減少了3.1％、4.6％、7.7％。甲醇、糖、乳酸、抗壞血酸等均不會影響生物傳感器對酒精的響應。結論：該酒精生物傳感器可以快速檢測血酒精濃度，表現(xiàn)出良好的特異性、重復性、準確性、穩(wěn)定性和抗干擾能力，可以為實驗室檢測血酒