E3B1基因的表達(dá)調(diào)控與軸突再生的相關(guān)性研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文E3B1基因的表達(dá)調(diào)控與軸突再生的相關(guān)性研究姓名：向強(qiáng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)（骨外）指導(dǎo)教師：周躍20080501第三軍醫(yī)入學(xué)博士學(xué)位論文建立大鼠急性脊髓損傷模型，采用免疫組織化學(xué)、RT—PCR、Westernblot研究方法，動(dòng)態(tài)觀測大鼠脊髓損傷前后脊髓組織中E381蛋白和E381mRNA的表達(dá)變化，分析了E3Bl基因表達(dá)變化在脊髓損傷中的意義。2、大鼠皮層神經(jīng)元的分離、培養(yǎng)、鑒定和CNS髓鞘質(zhì)的提取、

2、鑒定對(duì)大鼠大腦皮層組織進(jìn)行原代分離培養(yǎng)，觀察其生長和形態(tài)結(jié)構(gòu)，并采用GFAP與NF200熒光標(biāo)記，確認(rèn)神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量。提取了CNS髓鞘質(zhì)，觀測不同濃度CNS髓鞘質(zhì)對(duì)神經(jīng)元軸突生長的影響，選取最適實(shí)驗(yàn)濃度，并采用westemblot進(jìn)行成分鑒定。3、神經(jīng)元細(xì)胞E3Bl基因的表達(dá)變化檢測1)采用免疫細(xì)胞化學(xué)觀測了E381在培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)分布，采用RT—PCR、Westernblot檢測培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞中E381mRNA和E3Bl蛋

3、白的表達(dá)。2)培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞中加入提取的軸突生長抑制物CNS髓鞘質(zhì)，采用RT—PCR、Westemblot檢測了神經(jīng)元軸突抑制時(shí)E381蛋白和E381mRNA的表達(dá)變化。3)采用免疫熒光標(biāo)記對(duì)比觀測了培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞加入cNs髓鞘質(zhì)前后，E3Bl和BIII—tubulin在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)變化，分析了E3Bl基因表達(dá)變化與神經(jīng)元軸突生長抑制的相關(guān)性。4、E381基因的表達(dá)調(diào)控對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞軸突再生的影響1)針對(duì)E3Bl的RNA干擾質(zhì)粒

4、載體的構(gòu)建：選擇針對(duì)E3Bl(NCBI：NM—024397)的RNAi靶位點(diǎn)三個(gè)(分別命名為Abill，Abil2，Abil3)和已明確的不針對(duì)任何mRNA的RNAi靶位點(diǎn)～個(gè)(陰性對(duì)照，命名HK)，以及陽性對(duì)照GAPDH—A，選用帶有neoR選擇標(biāo)志和GFP綠色熒光標(biāo)志的真核表達(dá)載體pGenesil—1構(gòu)建E3BlRNAi質(zhì)粒。并進(jìn)行了抗性篩選、酶切、測序鑒定。2)RNA干擾對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞E381表達(dá)的影響研究：將構(gòu)建好的RNAi質(zhì)粒載

5、體通過“pofectamine2000依次轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞，采用熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染率，RT—PCR和Westernblot檢測針對(duì)E381不同靶位點(diǎn)的RNAi對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞E381基因表達(dá)的影響，并篩選出了對(duì)E381基因具有最佳抑制效應(yīng)的siRNA。3)調(diào)控E3Bl表達(dá)對(duì)神經(jīng)元軸突生長的影響：將篩選出的對(duì)E3Bl基因具有最佳抑制效應(yīng)的siRNA轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞，經(jīng)抗性篩選，加入軸突生長抑制物，采用BIII—tubu】in免疫熒光標(biāo)記和w