HIBD新生鼠Foxg1基因與腦皮質特定基因表達的相關性.pdf

1、研究背景：新生兒窒息致缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemicbrain damage，HIBD)是新生兒期常見的臨床疾病，已成為導致兒童腦癱、嚴重危害新生兒健康成長的重要原因。2003年我國進行第二次多中心治療觀察重度HIBD的預后，發(fā)現(xiàn)預后不良率仍高達20.8％，因此目前的治療手段對中重度HIBD的療效仍然很有限。近年對干細胞的研究表明，新生動物腦內(nèi)存在神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSC)，在HIBD后

2、，內(nèi)源性NSC可反應性增殖、分化以促進腦結構及功能的改善。但內(nèi)源性NSC反應性增殖、分化的力度很有限，其分化率較低。Liu等采用 5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標記技術追蹤觀察HIBD后海馬齒狀回新生NSC分化為神經(jīng)元的情況，發(fā)現(xiàn)在HIBD后15天，未見NSC分化為成熟神經(jīng)元，在26天后也僅有27％的BrdU陽性細胞分化為成熟神經(jīng)元。Masanori等追蹤觀察HIBD后沙鼠室管膜下區(qū)

3、及顆粒層NSC增殖及分化情況，表明在HIBD后10天室管膜下區(qū)NSC增加了3倍，追蹤觀察到60天也僅有少數(shù)細胞分化為表達神經(jīng)膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP，成熟星型膠質細胞表面標志)的星型膠質細胞和表達神經(jīng)元特異性核抗原(neuron-specific nuclear antigen，NeuN，成熟神經(jīng)元表面標志)的神經(jīng)元。因此，如何提高內(nèi)源性神經(jīng)干細胞在腦內(nèi)的增殖和神經(jīng)性分化

4、效率，真正發(fā)揮干細胞的替代修復作用值得深入研究。近年來研究表明，干細胞在腦內(nèi)的分化受局部微環(huán)境影響。因此，在HIBD后的病態(tài)微環(huán)境中是否存在某種因素抑制了內(nèi)源性神經(jīng)干細胞再生和神經(jīng)性分化，從而導致內(nèi)源性NSC的分化率較低，難以有效的重建大腦結構及功能值得深入研究。如能找到這一抑制性因素并采取針對性治療措施，將有望全面改善HIBD預后。 Foxg1基因是 FOX基因家族的一個重要成員，研究表明胚胎大腦發(fā)育過程中干細胞的增殖、分化受到關鍵基

5、因Foxgl的調控，該基因的表達缺陷將導致干細胞發(fā)育分化障礙，進一步導致大腦結構發(fā)育缺陷，且正常出生后Foxg1仍然持續(xù)表達于由端腦分化來的腦組織(大腦皮質、海馬、嗅球及基底核等)中，而發(fā)生HIBD時正是這些腦組織容易受到損傷。新生動物HIBD后腦結構與功能重建是胚胎期發(fā)育的再現(xiàn)和延續(xù)，因而Foxg1基因可能在HIBD后干細胞分化增殖的過程中扮演一重要角色因素。 目的：觀測HIBD后 Foxg1基因和腦皮質各層特定基因(Foxp

6、2，ER81，Otx1，F(xiàn)oxp1，RORβ)表達的動態(tài)變化分析兩者的相關性，初步探討是否存在HIBD后Foxg1基因水平的下降導致大腦皮質自身修復受限，表現(xiàn)為各層結構特定基因表達下調；觀測卡哈爾-雷濟厄斯細胞(Cajal-Retzius cells，CR 細胞)在發(fā)生HIBD后的變化情況，初步探討是否存在內(nèi)源性NSC向CR細胞分化增多，而向其它皮質層的成熟神經(jīng)細胞分化減少的現(xiàn)象。 方法：采用Rice法制作新生鼠HIBD動物模型

7、，假手術組作為對照組，分別在術后第3、7、14、28、56天取右側腦半球。半定量RT-PCR檢測標本中各個基因的表達，免疫組化檢測標本CR細胞數(shù)目變化。 結果： 1.模型鑒定：常規(guī)HE染色檢查結果顯示結扎側出現(xiàn)明顯的病理變化，病變在大腦皮層和海馬尤為明顯，主要為神經(jīng)元壞死，表現(xiàn)為空泡、核固縮、組織結構模糊及炎癥細胞增多等。 2.半定量RT-PCR結果： (1)Foxg1基因：Foxg1基因的表達在術后第3

8、、7、14、28、56天的結果分別為0.524±0.086，0.726±0.067，0.770±0.122，0.786±0.083，0.882±0.081；對照組的結果分別為0.798±0.121，0.787±0.078，0.664±0.109，0.744±0.096，0.757±0.065。兩組比較在第3天和第56天有顯著性差異?？傮w上模型組Foxg1基因的表達在早期出現(xiàn)明顯下調隨著時間的推移呈現(xiàn)出上升趨勢而對照組Foxg1基因表達相

9、對較穩(wěn)定。 (2)Reelin基因：Reelin基因的表達在術后第3、7、14、28、56天的結果分別為0.591±0.034，0.542±0.131，0.533±0.085，0.694±0.063，0.668±0.144；對照組的結果分別為0.565±0.113，0.329±0.062，0.474±0.081，0.553±0.073，0.618±0.104。兩者比較在第7天和第28天有顯著性差異?？傮w上模型組Reelin基因的

10、表達量在各個時間點均高于對照組。 (3)Foxp1基因：Foxp1基因的表達在術后第3、7、14、28、56天的結果分別為0.616±0.056，0.886±0.096，0.710±0.059，0.636±0.070，0.698±0.109；對照組的結果分別為0.737±0.115，0.743±0.102，0.746±0.108，0.735±0.082，0.899±0.064。兩者比較在第3、7、28和56天有顯著性差異。總體上

11、模型組Foxp1基因的表達水平是低于對照術組。 (4)ER81基因：ER81基因的表達在術后第3、7、14、28、56天的結果分別為0.654±0.096，0.942±0.068，0.724±0.094，0.838±0.105，0.977±0.123；對照組的結果分別為0.710±0.120，0.666±0.139，0.797±0.107，0.941±0.141，1.027±0.113。兩者比較在第7天有顯著性差異?？傮w上模型組

12、基因的表達水平低于對照組。 (5)Otx-1基因：術后第3天模型組Otx-1基因的表達未能檢測出而對照組正常測出。從術后第7天開始模型組和對照組均能夠檢測出，且在第7天后模型組Otx-1的表達水平高于對照組。模型組的表達在術后第3、7、14、28、56天的結果分別為0.000±0.000，0.713±0.122，0.570±0.134，0.535±0.037，0.551±0.044；對照組的結果分別為0.571±0.098，0.

13、466±0.137，0.463±0.133，0.462±0.121，0.401+0.061。兩者比較在第7天和第56天有顯著性差異。 (6)RORβ基因：RORβ基因的表達在術后第3、7、14、28、56天的結果分別為00.951±0.118，0.839±0.078，0.786±0.114，0.828±0.109，1.120±0.204；對照組的結果分別為0.984±0.133，0.868±0.169，1.060±0.225，1

14、.238±0.155，0.854±0.094。兩者比較在第14、28和56天有顯著性差異?？傮w上在發(fā)生HIBD后的前期RORβ基因的表達是降低的。 (7)Foxp2基因：Foxp2基因的表達在術后第3、7、14、28、56天的結果分別為0.460±0.107，0.526±0.119，0.566±0.164，0.455±0.050，0.570±0.061；對照組的結果分別為0.543±0.104，0.420±0.163，0.452

15、±0.055，0.469±0.043，0.422±0.055。兩者比較在第14天和第56天有顯著性差異。總體上在發(fā)生HIBD后的前期Foxp2基因的表達是降低的。 3.免疫組織化學結果：在進行免疫組化染色之后結果顯示模型組隨著時間的推移Reelin抗原陽性細胞(主要為CR細胞>增生明顯，而對照組細胞數(shù)目變化不大。鏡下顯示增生的陽性細胞分布不均且有團狀聚集傾向。模型組在第3、7、14、28、56天的陽性細胞數(shù)分別為24.9±2.4

16、24，31.4±4.452，42.3±2.908，47.1±1.853，45.5±2.173個；對照組陽性細胞數(shù)分別為21.7±2.627，21.7±3.199，21.8±3.190，22.4±2.221，27±2.000個。兩者在各個時間點比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)。 4.統(tǒng)計學結果：正常情況下即對照組中Otx1基因與Foxg1基因的表達呈正相關而模型組Otx1基因與Foxg1基因的表達卻變成了負相關，Reeli

17、n基因與Foxg1基因的表達在對照組中呈現(xiàn)負相關而模型組中卻變成了正相關，F(xiàn)oxp1、ER81、RORβ、Foxp2基因與Foxg1基因的關系在對照組和模型組中均呈現(xiàn)出負相關性。 結論：HIBD后新生鼠腦組織中Foxg1基因表達下調，皮質特定基因Reelin基因表達上調，F(xiàn)oxp2，ER81，Otx1，F(xiàn)oxp1和RORβ基因表達下調。由于HIBD后早期腦組織Foxg1基因的表達下調導致內(nèi)源性NSC向CR細胞分化增加而向各層腦皮