KIR和HLA-C基因多態(tài)性與慢性乙肝的相關(guān)性及HBV轉(zhuǎn)基因鼠單核細(xì)胞基因表達(dá)譜分析.pdf

1、第一部分，KIR和HLA-C基因多態(tài)性與慢性乙肝相關(guān)性的研究
　　 研究背景：
　　 慢性乙肝(CHB)是肝硬化和原發(fā)性肝癌的主要原因，世界上患有CHB的人數(shù)超過3.5億，而且四分之三的CHB病人在中國。然而，CHB發(fā)生的原因至今尚不完全清楚。目前，宿主遺傳因素受到重視，被認(rèn)為是導(dǎo)致病毒持續(xù)存在的主要原因。由于宿主的免疫反應(yīng)對病原體感染的結(jié)局起著關(guān)鍵的作用，因而許多研究都集中在免疫反應(yīng)基因上。而且，免疫反應(yīng)基因如人類白細(xì)

2、胞抗原一類(HLA-Ⅰ)和二類(Ⅱ)基因在人類基因組中顯示最高度的多態(tài)性，是研究其與乙肝病毒感染結(jié)局相關(guān)性的理想的候選基因。然而，以前研究報(bào)道的HLA多態(tài)位點(diǎn)和HBV感染臨床結(jié)局間的相關(guān)性，在不同種族人群中的結(jié)果很不一致。因此，免疫反應(yīng)中其它遺傳因素可能在CHB的發(fā)生中發(fā)揮作用。
　　 殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIRs)基因具有多基因性和多態(tài)性，它們編碼的分子主要表達(dá)在自然殺傷細(xì)胞(NK)和某些T細(xì)胞亞群上。NK細(xì)胞在先天性抗

3、病毒感染免疫反應(yīng)中發(fā)揮主要作用，部分是通過KIRs與表達(dá)在感染宿主細(xì)胞上它們的HLA-Ⅰ類配體的相互作用。與NK細(xì)胞上KIRs識別特別相關(guān)的是多態(tài)性的HLA-C分子。功能性KIR基因編碼活化性和抑制性受體。迄今為止，已確定的人KIRs基因總共有17個(gè)，其中9個(gè)是NK細(xì)胞抑制性的(KIR2DL1-4，2DL5A，2DL5B，3DL1-3)，6個(gè)是活化性的(KIR2DS1-5，3DS1)，2個(gè)是假基因（KIR2DP1，3DP1）。另外，不同

4、的KIR基因組合在一起形成可遺傳的單體型。盡管這些單體型在包含基因的數(shù)量和種類上各不相同，然而，通常根據(jù)基因成分的不同，KIR單體型能被分成兩個(gè)基本類別，即A類和B類。A類比B類簡單，含有較多的抑制性基因，而B類單體型KIR基因的數(shù)目變化較大，其中更多的基因編碼活化性KIR。至今，已公布的不同的B類單體型超過20種?，F(xiàn)已明確，個(gè)體間含有不同數(shù)量的KIR抑制性和活化性基因。
　　 KIRs對HLA-C配體分子的識別依賴于HLA-C

5、分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。多態(tài)性的HLA-C等位基因根據(jù)HLA-C分子上80位的氨基酸是天冬酰胺(Asn80)還是賴氨酸(Lys80)表位，大體上可分成C1型和C2型。一些KIRs現(xiàn)已明確具有HLA-C識別特異性。KIR2DL1和KIR2DS1結(jié)合含有Lys80的HLA-C分子(HLA-C2)，而KIR2DL2、KIR2DL3和KIR2DS2則識別含有Asn80的HLA-C分子(HLA-C1)。
　　 NK細(xì)胞的活性不但受抑制性受體，而且

6、受活化性受體的調(diào)節(jié)，這些受體識別靶細(xì)胞上的HLA-C分子。因此，抑制信號和活化信號博弈的最終結(jié)果可能控制NK細(xì)胞殺傷脅迫細(xì)胞的能力。在體內(nèi)，NK細(xì)胞在受體構(gòu)成上處于抑制性受體的控制之下。因而，僅當(dāng)活化信號的作用超越抑制信號時(shí)，NK細(xì)胞才能發(fā)揮效應(yīng)功能。由于KIR和HLA基因的高度多態(tài)性以及它們各自獨(dú)立的分布特點(diǎn)，加之KIR對特定HLA同種異型分子識別的特異性，個(gè)體間會出現(xiàn)各種不同的受體/配體組合譜型。這些HLA/KIR組合可能會相應(yīng)地導(dǎo)

7、致NK細(xì)胞活化閾值的差異。因此，人群中由這些遺傳下來的多態(tài)性基因所決定的不同配體/受體組合可使效應(yīng)細(xì)胞表現(xiàn)不同的功能，這能強(qiáng)烈影響個(gè)體對疾病的易感性。此前的幾項(xiàng)研究表明，KIR受體/配體組合參與不同種類疾病的發(fā)生和發(fā)展。一項(xiàng)KIR2DL3和HLA-C1相互作用對丙型肝炎病毒(HCV)感染影響的研究顯示，NK細(xì)胞的抑制性降低對HCV的感染具有保護(hù)作用。因此，在本研究中，我們假設(shè)KIR/HLA-C組合與CHB的發(fā)生可能也具有相關(guān)性。

8、　　 目的：
　　 通過比較等位基因、基因型、單體型以及KIR/HLA-C組合頻率在CHB病例組與對照組中的分布，探討多態(tài)性HLA-C、KIR基因和KIR/HLA-C基因組合與CHB的相關(guān)性。
　　 研究方法：
　　 研究對象:本研究依據(jù)CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇CHB患者182例（男性100例，女性82例），同時(shí)選擇140例健康個(gè)體（男性75例，女性65例）作為對照。兩組個(gè)體均來自于同一種族。所有個(gè)體沒有HCV、丁

9、型肝炎病毒以及HIV感染的血清學(xué)證據(jù)，也無其它如糖尿病、惡性腫瘤和自身免疫性疾病。本研究經(jīng)山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及參與者的知情同意。
　　 基因分型:通過序列特異性引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-SSP)對HLA-C等位基因和KIR基因進(jìn)行基因分型。采用DRB1的基因片段作為陽性對照，同時(shí)每一批擴(kuò)增反應(yīng)都包含陰性對照。對PCR-SSP基因分型標(biāo)本的10％及少數(shù)不能確定結(jié)果的標(biāo)本，結(jié)合KIR的HLA-C80位置處的特異性基

10、序通過基因測序確證。除2DS5外，所有KIR基因位點(diǎn)都采用兩套引物，以確保KIR基因分型的準(zhǔn)確性。根據(jù)Witt等和Hsu等建立的模型確定KIR的基因型和單體型。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:Hardy-Weinberg遺傳平衡的檢驗(yàn)使用x2檢驗(yàn)。病例組與對照組之間等位基因、基因型、單體型和KIR/HLA-C基因組合頻率的比較采用x2檢驗(yàn)，必要時(shí)使用Fisher確切概率檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.在CHB病例組和對照組之

11、間，HLA-C等位基因分布相似，各等位基因頻率沒有顯著差異;而在CHB組中，HLA-C2等位基因的頻率明顯高于對照組(P=0.006)。
　　 2.在CHB病例組中，HLA-C1C1純合基因型的頻率明顯低于對照組（P=0.01）。
　　 3.在CHB病例組和對照組之間，KIR基因、單體型和基因型的分布沒有顯著差異。
　　 4.在CHB病例組中，KIR2DL1與HLA-C2組合的頻率明顯高于對照組(P=0.013)

12、。
　　 5.在CHB病例組中，KIR2DL3或KIR2DL3純合型與HLA-C1C1組合的頻率明顯低于對照組（分別為P=0.011和P=0.024）。
　　 結(jié)論：
　　 1.抑制性受體KIR2DL1與HLA-C2配體的組合是CHB的易感因素。
　　 2.抑制性受體KIR2DL3或KIR2DL3純合型與HLA-C1C1配體的組合是CIIB的保護(hù)性因素。
　　 第二部分，HBV轉(zhuǎn)基因鼠單核細(xì)胞基因

13、表達(dá)譜分析
　　 研究背景：
　　 乙型肝炎病毒(HBV)屬于嗜肝DNA病毒科,是引起乙型病毒性肝炎的病原體。肝臟是HBV的主要復(fù)制器官,但HBV感染并不僅限于肝細(xì)胞,HBV感染也存在于骨髓和外周血單個(gè)核細(xì)胞。雖然在急、慢性乙肝患者外周血B細(xì)胞、單核細(xì)胞(Mo)、CD4+和CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞均可檢測到HBV的DNA和RNA,但Mo和B細(xì)胞的病毒載量和感染率明顯高于其它淋巴細(xì)胞。
　　 近年來HBV感染和自身

14、免疫性疾病關(guān)聯(lián)性的研究取得較大進(jìn)展。臨床和實(shí)驗(yàn)研究顯示,某些感染如HBV可能保護(hù)易感個(gè)體發(fā)生自身免疫性疾病(SLE和多發(fā)性硬化)。臨床研究發(fā)現(xiàn),慢性HBV感染合并SLE患者狼瘡活動性、蛋白尿和抗dsDNA抗體滴度均明顯低于非合并慢性乙肝(CHB)的SLE患者。以上發(fā)現(xiàn)提示HBV感染和SLE之間存在關(guān)聯(lián)性,HBV感染可能對SLE的發(fā)生發(fā)展具有拮抗(保護(hù))作用,但缺乏充分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。我們在前期研究中以降植烷(pristane)誘導(dǎo)的狼瘡鼠為模

15、型,初步探討了HBV感染是否對SLE具有保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。我們的腎組織病理和血清學(xué)結(jié)果均顯示HBV能減輕pristane誘導(dǎo)狼瘡樣小鼠的病理損傷,對SLE具有保護(hù)作用。根據(jù)既往研究報(bào)道和我們的前期研究發(fā)現(xiàn),推測HBV感染對SLE可能保護(hù)作用的機(jī)制是：①抑制Mo異?；罨虰AFF、TNF-α產(chǎn)生；②抑制B細(xì)胞活化和自身抗體分泌；③促進(jìn)T細(xì)胞分泌IL-2和抑制其IL-17的產(chǎn)生 單核細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的主要組分,承擔(dān)啟動炎癥、產(chǎn)生細(xì)

16、胞因子、募集其它免疫細(xì)胞、吞噬和抗原呈遞等多種免疫功能,它將先天性和固有免疫系統(tǒng)聯(lián)系起來。近來的研究發(fā)現(xiàn)紅斑狼瘡患者的單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞有表面蛋白表達(dá)、細(xì)胞因子產(chǎn)生以及吞噬等功能的缺陷。單核細(xì)胞功能異常越來越被認(rèn)為在各種自身免疫性疾病特別是SLE的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　 HBV感染可影響單核細(xì)胞的基因表達(dá),鑒于單核細(xì)胞在SLE發(fā)生機(jī)制中的重要作用,單核細(xì)胞的功能改變可能影響SLE的發(fā)生及病理進(jìn)程。幾項(xiàng)HBV感染與SLE關(guān)系

17、的研究結(jié)果提示,HBV感染可能通過改變單核細(xì)胞的功能來影響SLE的發(fā)生發(fā)展。然而,HBV感染對Mo基因表達(dá)譜的影響目前尚不清楚。在本研究中,我們應(yīng)用HBV轉(zhuǎn)基因鼠模型探討HBV感染對單核細(xì)胞基因表達(dá)的影響。
　　 目的：
　　 通過對HBV轉(zhuǎn)基因鼠和對照鼠脾單核細(xì)胞基因表達(dá)譜的比較,分析HBV感染單核細(xì)胞的差異表達(dá)基因；探索單核細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)變化在SLE發(fā)生發(fā)展中的作用,為進(jìn)一步闡明HBV感染與SLE的關(guān)系提供依據(jù)

18、。
　　 研究方法：
　　 摘除雌性HBV轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠與對照BALB/c小鼠的脾臟,制備脾單細(xì)胞懸液,分離單個(gè)核細(xì)胞。用磁分選法從脾單個(gè)核細(xì)胞中分離Mo。提取總RNA。在基因芯片分析系統(tǒng)上進(jìn)行cRNA的合成、標(biāo)記、芯片雜交,掃描、資料獲取和分析。分析實(shí)驗(yàn)組與對照組各個(gè)探針位點(diǎn)熒光強(qiáng)度的比值(Ratio值)。Ratio值大于2.0時(shí)被認(rèn)為有顯著表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.HBV轉(zhuǎn)基因鼠與對

19、照鼠相比,脾單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)有差異的基因共計(jì)125個(gè),其中表達(dá)升高的有99個(gè),表達(dá)降低的有26個(gè)。表達(dá)有差異的基因中與免疫相關(guān)的有10個(gè),腫瘤相關(guān)的10個(gè),信號通路相關(guān)的3個(gè),細(xì)胞代謝相關(guān)的16個(gè),離子通道相關(guān)的3個(gè),細(xì)胞凋亡相關(guān)的2個(gè),轉(zhuǎn)錄相關(guān)的5個(gè),神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)的8個(gè),與某些疾病相關(guān)的有11個(gè)以及功能不明確的基因57個(gè)。
　　 2.與對照鼠相比,HBV轉(zhuǎn)基因鼠脾單核細(xì)胞免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因中,上調(diào)表達(dá)的有7個(gè),下調(diào)表達(dá)

20、的有3個(gè)。上調(diào)表達(dá)的基因包括幾個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域基因、干擾素誘導(dǎo)基因、C反應(yīng)蛋白樣基因(APC)以及Fas相關(guān)的基因(FADD);下調(diào)表達(dá)的基因包括G蛋白偶聯(lián)受體基因、G蛋白信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子基因以及趨化因子配體基因(CXCL2)。
　　 結(jié)論：
　　 1.HBV感染可改變單核細(xì)胞的基因表達(dá)譜。HBV感染單核細(xì)胞的差異表達(dá)基因參與免疫、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞代謝等多種功能。
　　 2.HBV感染單核細(xì)胞中免疫相關(guān)基因APC