應用非線性光學成像技術診斷移植腎間質纖維化的初步研究.pdf

1、研究背景:腎移植作為終末期腎病的最佳替代治療選擇在全世界廣泛的開展，我國是僅次于美國的第二大移植大國。至2002年底，全世界納入統(tǒng)計的腎移植數(shù)量超過55萬例次，親屬腎移植存活時間最長者達39年，尸體腎移植達30年。隨著配型技術的提高和新型免疫抑制劑不斷應用于臨床，腎移植的近期效果明顯提高，移植腎半數(shù)生存時間由原來的6.7年提高到10.9年。但據統(tǒng)計過去10年移植腎長期存活卻沒有明顯改善。而幾乎所有移植腎都存在慢性間質纖維化的過程，35～

2、40％的移植腎失功是由于間質纖維化直接導致。因此研究如何診斷和防治移植腎間質纖維化，延長移植腎的長期生存壽命，成為亟待解決的問題。
　　 移植腎間質纖維化(RAIF)是損傷因素和修復因素不斷作用的結果，其實質是膠原纖維在腎間質堆積和改造的過程。目前實驗研究表明眾多細胞因子與纖維化關系密切。TGF-β在腎間質纖維化過程中起著關鍵的作用;AT-Ⅱ能夠促進成纖維細胞的增生，抑制其凋亡，促進腎間質纖維化發(fā)生；尚;包括ET-1、IL-1、

3、PDGF、TNF-α等因子參與腎臟纖維化的過程。這些血清學指標雖可以間接反應腎間質纖維化的程度，但無特異性。而目前“金標準”腎組織活檢是基于膠原纖維特殊性染色和病理醫(yī)生的人為評估，客觀性和重復性差，對腎間質纖維化的評估比較粗略，無法進行精確的定量分析。
　　 非線性光學成像技術為研究組織內膠原纖維提供了一種新的方法。在非線性光學成像技術中，二次諧波(SHG)最適合對組織非中心對稱性分子進行成像，SHG信號強弱與生物組織中的膠原含

4、量密切相關，能特異性顯示纖維性膠原沉積情況及三維形態(tài)。雙光子激發(fā)熒光(TPEF)是另外一種光學現(xiàn)象，標本無需熒光染色，直接獲取組織內的天然熒光信號來顯示組織細胞等結構。兩種成像裝置兼容，復合成像可以互為印證和補充，直接展現(xiàn)組織形態(tài)。目前已用于包括角膜、鼠尾肌腱、人的皮膚及疤痕組織、小鼠的腎臟、大鼠的肝臟、人的肝臟等膠原纖維的成像，以及用于鼻咽癌、腎癌、肝癌等腫瘤判斷良惡性、是否復發(fā)等多個生物醫(yī)學領域。與傳統(tǒng)病理染色技術相比，非線性光學成

5、像技術有以下優(yōu)勢:①SHG能夠區(qū)分纖維膠原和非纖維膠原蛋白，對病理性膠原纖維堆積具有特異性，可以定量測定。②組織標本無需染色，可以排除染料成分、染色步驟或褪色等原因產生的染色差異;可以避免受到使用熒光劑所帶來的濃度和光漂白效應的影響。③可以顯示纖維膠原三維結構。④TPEF可以補充結構和細胞成分信息。
　　 目的:
　　 1.收集病理資料，掌握我科移植腎活檢病理的相關數(shù)據資料，為下一步實驗選擇病例及準備標本。
　　

6、 2.了解非線性光學成像技術對移植腎間質纖維化的成像效果，并與傳統(tǒng)病理方法對比來驗證其優(yōu)勢。
　　 3.探索使用非線性光學成像技術進行移植腎間質纖維化的定量方法。
　　 方法:
　　 1.病理資料的收集
　　 a)研究對象研究對象為2005-2011年之間在我科行移植腎活檢術并且可以查找到完整病理資料及相關臨床資料的患者，共有663例次。包括尸體腎移植，親屬活體腎移植及臨床心臟死亡捐獻的腎移植受者的腎活檢

7、資料。
　　 b)研究內容資料收集的內容包括:患者的基本信息;移植腎穿刺活檢的指征分布;病理結果的分布;特殊病理結果的分析及相關臨床資料等。
　　 c)研究方法所有收集的病理標本均在我院病理科獲得，病理切片常規(guī)進行HE、Masson、PAS染色。所有病理報告都是由病理科醫(yī)師依照Banff05和Banff07的標準進行病理診斷及分級。
　　 2.非線性光學成像技術在移植腎間質纖維化診斷中的應用
　　 a)病

8、例收集從上面收集的663例次的腎活檢病理資料中選出40例患者的40次病理活檢資料，輕度纖維化22例，中重度纖維化18例，收集其病理資料及相關臨床資料。收集了2只正常wistar大鼠右側腎臟組織。
　　 b)標本準備在我院病理科獲取40例患者移植腎活檢組織的石蠟標本，并將2只大鼠右腎組織標本進行石蠟包埋。病理切片厚度為4μm，連續(xù)切2張病理切片，分別標記為1、2，將標本脫蠟晾干，第1張行HE染色。第2張切片脫蠟晾干后無需做任何處理

9、，直接使用非線性光學設備獲取SHG/TPEF圖片，再將第2張切片行Masson染色。以比較同一切片相同部位2種方法對間質纖維化的成像情況，減少誤差。
　　 c)實驗方法所有的傳統(tǒng)病理染色方法均在我院病理科完成，均按照傳統(tǒng)的HE、Masson染色方法進行。非線性光學成像技術的方法包括:登陸Genesis操作軟件系統(tǒng)→按界面指示載入病理切片標本→設置掃描參數(shù)→選定掃描區(qū)域→開始掃描圖片→將所掃描的圖片按照掃描的先后秩序進行拼合，圖片

10、存為“tif”格式。其中人移植腎穿刺標本沿標本長軸將整個標本全部掃描完成。大鼠腎臟標本按照皮質5個區(qū)域、髓質3個區(qū)域、集合系統(tǒng)1個區(qū)域進行掃描，每個區(qū)域大小按照5×5張（每張圖片分辨率為512×512 pixel，放大倍數(shù)為20倍）。
　　 3.探索使用SHG/TPEF圖像進行移植腎間質纖維化的定量分析方法
　　 a)研究對象:實驗中同一張切片所取得的SHG/TPEF圖像和Masson圖像，共采集了20張標本圖像。

11、>　　 b)研究內容:使用Image-Pro-Plus6.0(IPP)圖像處理軟件對實驗中取得的SHG/TPEF圖像及Masson圖像進行分析，定量分析移植腎間質纖維化。
　　 c)研究方法:使用IPP軟件的圖像計算功能對SHG/TPEF圖像及Masson圖像中纖維化面積占整張圖片的面積百分比進行計算。主要步驟包括:進入軟件界面→打開分析圖片→設置計算參數(shù)→選定纖維化范圍→計算并輸出結果。
　　 4.統(tǒng)計方法: 計量資

12、料的描述以均數(shù)±標準差（X±SD）來表示，兩組患者的基本資料采用兩獨立樣本的t檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對SHG/TPEF圖片定量法和Masson圖片定量法得出的分級結果進行平行效度檢驗，得出的kappa值＞0.75表示一致性好，0.40≤kappa值≤0.75表示一致性較好，kappa值＜0.4表示一致性差。
　　 結果:
　　 1.該科2005-2011年期間移植腎活檢病理資

13、料及相關臨床資料分析
　　 移植腎活檢最主要的指征是不明原因的血肌酐升高，占全部指征的74.36％，第二位的活檢指征是蛋白尿/血尿。移植腎病理結果顯示排斥反應占59.28％，其中急性排斥反應204例次(30.77％)，慢性排斥反應189例次(28.51％)。分析近幾年數(shù)據發(fā)現(xiàn)我科急性排斥的發(fā)生率呈下降趨勢。病理結果中還發(fā)現(xiàn)新發(fā)/復發(fā)性腎病9例，乙肝相關性腎病9例。
　　 整理了15例部分程序性腎活檢病例，發(fā)現(xiàn)其中5例出現(xiàn)

14、早期的腎臟病變，其中1例診斷為IgA腎病，另有2例發(fā)現(xiàn)了輕度的腎小管萎縮腎間質纖維化，2例診斷為隱匿性排斥反應。
　　 2.非線性光學成像技術在移植腎間質纖維化診斷中的應用
　　 獲得的SHG/TPEF圖像由SHG信號和TPEF信號相互疊加而成。其中SHG圖像呈綠色信號，代表膠原纖維組織;TPEF圖像呈紅色信號，代表腎組織圖像。大鼠腎臟和人移植腎活檢組織標本的SHG/TPEF圖像都可以清晰的分辨出腎小球、腎小管、腎血管等

15、腎組織的鏡下結構，可以觀察到腎間質和腎小球、腎小管及腎血管周圍分布的呈綠色信號的膠原組織沉積。SHG/TPEF圖像既能夠清晰顯示腎臟膠原纖維及腎組織結構，又可以呈現(xiàn)纖維膠原在腎臟中沉積的部位。
　　 與傳統(tǒng)的Masson染比較，SHG/TPEF圖像也可以清晰的顯示腎組織的基本結構。對于輕度移植腎間質纖維化的標本，SHG/TPEF圖像可以清晰的顯示在腎小球周圍、腎小血管周圍、腎小管周圍及腎間質內少量散在的呈綠色信號的膠原纖維沉積，

16、而Masson染色基本正常，未發(fā)現(xiàn)輕度的纖維化表現(xiàn)。對于中重度移植腎間質纖維化的標本，SHG/TPEF圖像顯示與Masson染色基本相同，但可以更直觀更容易的觀察到呈綠色信號的纖維膠原分布的范圍及沉積的部位。
　　 3.移植腎間質纖維化的定量方法
　　 由于SHG/TPEF圖像只有紅色和綠色兩種顏色組成，使用IPP軟件可以很輕松的對SHG/TPEF圖像上呈綠色的纖維膠原面積百分比進行定量計算。根據計算結果得出的Banff

17、分級與臨床病理報告分級基本吻合。同時將SHG/TPEF圖像定量法與Masson圖像定量法得出的結果進行平行效度檢驗，得出kappa值為0.835，表示兩種方法的結果一致性好。
　　 結論：
　　 1.移植腎活檢是確診移植腎病變的重要方法，程序性活檢還可以及時發(fā)現(xiàn)早期隱匿性的移植腎病變。移植腎活檢在協(xié)助臨床明確疾病診斷，指導臨床治療方面起著至關重要的作用，對提高移植腎遠期存活時間意義重大。
　　 2.非線性光學成像