扁桃酸的立體選擇性代謝和手性轉(zhuǎn)化機制研究.pdf

1、扁桃酸(mandelic acid，MA)，又名苦杏仁酸和α-羥基苯乙酸，是尿路殺菌劑扁桃酸烏洛托品、末稍血管擴張劑環(huán)扁桃酸、滴眼藥羥芐唑及阿托品類解痙劑的重要中間體，同時也是苯乙烯的尿中主要代謝物。最早關(guān)于MA代謝的研究顯示MA在人和狗的體內(nèi)可部分脫氫生成苯乙酮酸(PGA)。1990年Drummond等研究發(fā)現(xiàn)MA在大鼠體內(nèi)至少有2種代謝途徑：S-MA手性轉(zhuǎn)化為R-MA和進一步代謝生成PGA。首次發(fā)現(xiàn)MA在體內(nèi)除代謝為PGA外，還會發(fā)

2、生手性轉(zhuǎn)化。本實驗室的研究發(fā)現(xiàn)，MA在SD大鼠體內(nèi)發(fā)生了很強的立體選擇性代謝。MA在哺乳類動物中的立體選擇性代謝和手性轉(zhuǎn)化機理至今尚不清楚，人體中MA是否也會發(fā)生立體選擇性代謝和手性轉(zhuǎn)化，也有待研究。本實驗通過分子克隆、化學(xué)合成等技術(shù)和多種體外代謝模型研究扁桃酸的立體選擇性代謝和手性轉(zhuǎn)化過程，探討MA立體選擇性代謝和手性轉(zhuǎn)化過程的內(nèi)在機制，具有極其重要的意義。
　　 目的:克隆、表達(dá)人和大鼠醇脫氫酶(ADH)、醛，酮還原酶(AK

3、R)全長cDNA，研究扁桃酸(MA)的立體選擇性代謝和手性轉(zhuǎn)化機制，同時采用分子對接的方法分析配體MA對映體與人ADH2配體結(jié)合區(qū)的相互作用，另外還采用各種體外代謝模型研究MA代謝酶存在的部位、輔酶依賴性等性質(zhì)?；瘜W(xué)合成S-MA-CoA硫酯，考察其在大鼠肝勻漿中水解的構(gòu)型轉(zhuǎn)化情況，探討MA的手性轉(zhuǎn)化機制。
　　 方法:1)設(shè)計引物，利用RT-PCR克隆人和SD大鼠醇脫氫酶、醛-酮還原酶基因全長cDNA。測序正確的cDNA被克隆到

4、表達(dá)載體pET-28a(+)上并在大腸桿菌BL21(DE3)中穩(wěn)定表達(dá)。利用親和色譜純化相應(yīng)的酶，通過檢測其在340nm吸光度值的變化進行酶活性測定。獲得的醇脫氫酶與MA對映體，醛-酮還原酶與PGA共孵育，采用HPLC分析其代謝和轉(zhuǎn)化情況。同時將MA與人ADH2配體結(jié)合腔進行分子對接，從能量和結(jié)合模式上分析MA對映體與蛋白的結(jié)合情況。另外還考察扁桃酸結(jié)構(gòu)類似物鄰氯扁桃酸和苯乙二醇在人和大鼠醇脫氫酶中的代謝。2)采用CaCl2沉淀法制備人

5、、大鼠、小鼠肝和肺微粒體，同時制備大鼠肝S9、微粒體、線粒體、胞漿蛋白，分別與20μg·mL-1 MA單個對映體于37℃孵育2h，HPLC檢測體外立體選擇性代謝情況，同時分別添加NADPH、NADP、NADH、NAD四種輔因子，考察它們對MA代謝的影響；此外，采用蘋果酸脫氫酶抑制劑草酰乙酸、5-單磷酸腺苷進行體外抑制實驗，并購買商品化的豬心蘋果酸脫氫酶來探討MA的代謝是否由該酶介導(dǎo)。3)化學(xué)合成S-MA-CoA硫酯，UPLC-MS/MS

6、鑒定，采用半制備柱進行色譜純化，純化后冷凍干燥，與SD大鼠肝勻漿共孵育，用普通HPLC和柱前手性衍生化色譜分析產(chǎn)物及產(chǎn)物的構(gòu)型情況。
　　 結(jié)果:1)通過測序，目的蛋白的cDNA序列完全正確，在宿主菌中獲得良好的可溶性表達(dá)，經(jīng)Ni2+親和柱純化后目的蛋白達(dá)到了電泳純，具有較好的催化活性。人ADH2對扁桃酸的代謝具有立體選擇性，優(yōu)先代謝S-MA，對S-MA的代謝能力較強。大鼠ADH1對扁桃酸無代謝，人和大鼠AKR對苯乙酮酸均無代謝

7、。鄰氯扁桃酸和苯乙二醇在人和大鼠醇脫氫酶中均無代謝。對接結(jié)果顯示，人ADH2蛋白上的3個氨基酸殘基與S-MA形成5個氫鍵作用，而僅2個氨基酸殘基與R-MA形成2個氫鍵作用，從能量和結(jié)合模式上分析，S-MA與蛋白結(jié)合更加穩(wěn)定，因此其優(yōu)先代謝S-MA。2)MA兩個對映體在大鼠、小鼠和人肝、肺微粒體中保持穩(wěn)定，未檢測到PGA； S-MA在SD大鼠肝S9、胞漿、線粒體蛋白中被代謝生成PGA，而R-MA在各組分蛋白中無代謝。線粒體和胞漿蛋白代謝M

8、A生成PGA量相當(dāng)。加入各種輔因子后，MA的代謝未見增強。5-單磷酸腺苷和草酰乙酸抑制S-MA在SD大鼠胞漿蛋白和線粒體蛋白中的代謝，并且抑制效應(yīng)隨著抑制劑濃度的不斷升高而增強。當(dāng)草酰乙酸濃度增加至10mmol·L-1時，酶活性完全被抑制，S-MA不被代謝；當(dāng)5-單磷酸腺苷濃度達(dá)到7.5 mmol·L-1時，約80％的酶活性被抑制。MA對映體在豬心蘋果酸脫氫酶中均未發(fā)生變化，添加任-輔因子也都未有PGA生成。3)合成的黃色固體結(jié)晶經(jīng)MS

9、初步檢測顯示有m/z900([MA-CoA-H]-)的分子離子峰，二級質(zhì)譜對m/z100～950范圍的離子進行全掃描顯示m/z900母離子的子離子峰除m/z766([CoA-H]-)峰外，其他的子離子和CoA的子離子碎片峰完全一致，主要有m/z686、408、338、159、134等，表明合成的化合物為目標(biāo)化合物，并成功純化。非手性HPLC顯示，S-MA-CoA經(jīng)過孵育后，有MA的生成；衍生化后手性色譜分析顯示S-MA-CoA經(jīng)過孵育后

10、水解生成了R-MA。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建人和大鼠醇脫氫酶、醛.酮還原酶的表達(dá)質(zhì)粒，獲得高活性的蛋白，用于MA的體外代謝研究。大鼠體內(nèi)負(fù)責(zé)代謝MA的酶為非微粒體酶，可能同時存在于胞漿和線粒體中。5-單磷酸腺苷和草酰乙酸對S-MA在大鼠胞漿蛋白和線粒體蛋白中的代謝均有較強的抑制作用，提示我們MA在大鼠體內(nèi)極有可能是由蘋果酸脫氫酶代謝的。成功合成S-MA-CoA硫酯，在大鼠肝勻漿中水解產(chǎn)生R-MA，由此推斷MA的手性轉(zhuǎn)化機制應(yīng)該與洛