PPARγ激動(dòng)劑對(duì)糖尿病大鼠腎臟及高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞TSP-1、BMP-7表達(dá)的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎?。―N）是糖尿?。―M）常見(jiàn)而嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥，已成為終末期腎衰竭（ESRD）的主要原因之一，因而，探索DN的發(fā)病機(jī)制及有效的防治措施是當(dāng)今倍受腎病學(xué)者關(guān)注的課題。隨著對(duì)腎小管間質(zhì)病變?cè)谀I臟疾病進(jìn)展與預(yù)后中作用的研究，發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)病變?cè)贒N的發(fā)生發(fā)展中有著不可忽視的作用。研究DM小管間質(zhì)病變發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，以及尋找干預(yù)治療小管間質(zhì)病變的措施具有重要意義。故本課題旨在研究高糖情況下腎小管間質(zhì)改變并探討干預(yù)措施。有

2、關(guān)腎小管周圍毛細(xì)血管（PTC）病變?cè)谀I間質(zhì)纖維化中的作用，近年來(lái)才開(kāi)始得到重視。具有強(qiáng)烈抑制血管生成的血小板反應(yīng)蛋白1（TSP-1）與腎臟疾病關(guān)系越來(lái)越受到關(guān)注。近年研究表明在活化潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）中，TSP-1具有重要作用。從時(shí)間表達(dá)與空間分布看，TSP-1高表達(dá)與局部活化的TGF-β1表達(dá)相一致，推測(cè)其可能參與了腎臟纖維化進(jìn)展。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）是TGF-β的下游效應(yīng)介質(zhì)，在一些包括DN的病理狀態(tài)下，特別

3、是在伴有細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成增加的腎小球系膜區(qū)CTGFmRNA的表達(dá)明顯增加。由此可以認(rèn)為CTGF參與了腎纖維化的發(fā)生發(fā)展。骨形成蛋白-7（BMP-7）是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）家族的一員。近年來(lái)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，某些腎臟病的發(fā)生與BMP-7減少有關(guān)，而B(niǎo)MP-7治療則可減輕腎臟損害，具有抗纖維化的作用。同時(shí)，它們?cè)贒N的發(fā)生和治療中的作用也日益引起人們的關(guān)注。羅格列酮（RSG）是人工合成新型抗DM的噻唑烷二酮類（TZDs

4、）藥物，在提高胰島素敏感性方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用。TZDs還具有抗器官硬化和抗組織纖維化等作用。但在DN RSG是否通過(guò)影響TSP-1、BMP-7及CTGF的表達(dá)而抗纖維化，目前尚缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用糖尿病大鼠模型和高糖培養(yǎng)的人的腎小管上皮細(xì)胞，觀察不同時(shí)間點(diǎn)高糖培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）及實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)TSP-1、CTGF、BMP-7、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)情況，以及與間質(zhì)細(xì)胞增殖、纖維連接蛋白（FN

5、）沉積、間質(zhì)纖維化等的關(guān)系，探討TZDs類藥物對(duì)DN的保護(hù)作用及其可能的與TSP-1、CTGF、BMP-7等相關(guān)的機(jī)制，為臨床研究DN的發(fā)病機(jī)理及治療措施提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.糖尿病大鼠腎臟TSP-1、BMP-7的表達(dá)變化
　　 選擇體重180-200g健康雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為二組，正常對(duì)照組（A組）和糖尿病組（B組），每組12只。B組大鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素（STZ，60mg/kg，

6、溶于0.1mol/L檸櫞酸緩沖液，濃度為1％，pH值為4.5）制備糖尿病大鼠模型，A組只注射相同體積的枸櫞酸緩沖液。72小時(shí)后尾靜脈采血，用血糖儀測(cè)定全血血糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖為+++～++++時(shí)確定為糖尿病大鼠模型。分別于成模后4、8周各組任取6只測(cè)定大鼠血糖（BG）、血肌酐（Scr）、尿肌酐（Ucr）、肌酐清除率（Ccr）、尿n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性，24小時(shí)尿白蛋白排泄率（UAER）。對(duì)腎臟標(biāo)

7、本進(jìn)行光鏡HE、PAS及MASSON染色。免疫組化方法測(cè)定腎皮質(zhì)TSP-1、BMP-7、CTGF、FN、α-SMA表達(dá)；各組大鼠腎皮質(zhì)提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法測(cè)定大鼠腎皮質(zhì)TSP-1、BMP-7、CTGFmRNA表達(dá)，Western blot法檢測(cè)腎組織中TSP-1、BMP-7、CTGF的蛋白表達(dá)。
　　 2.RSG對(duì)DM大鼠腎臟TSP-1、BMP-7表達(dá)影響的干預(yù)研究
　　 選擇體重18

8、0-200g雄性SD大鼠18只。所有動(dòng)物隨機(jī)分為三組，正常對(duì)照組（A組）、糖尿病組（B組）及糖尿病RSG治療組（C組），每組6只。B組及C組大鼠腹腔單劑量注射STZ（60mg/kg），A組注射等量枸櫞酸緩沖液。72小時(shí)后尾靜脈采血，用血糖儀測(cè)定全血血糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖為+++～++++時(shí)確定為糖尿病大鼠。A組：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中正常飼養(yǎng)，每日灌胃與治療組等容積的自來(lái)水。B組：成模后從第二天開(kāi)始每日灌胃與治療組等容積的自來(lái)水。C

9、組：成模后第二天開(kāi)始灌胃羅格列酮30mg/kg，于實(shí)驗(yàn)第8周末，測(cè)定各組大鼠BG、Scr、Ucr、Ccr，尿NAG酶活性，24小時(shí)UAER。對(duì)腎臟標(biāo)本進(jìn)行光鏡HE、PAS及MASSON染色。免疫組化方法測(cè)定腎皮質(zhì)TSP-1、BMP-7、CTGF、FN、α-SMA表達(dá)；各組大鼠腎皮質(zhì)提取總RNA，用RT-PCR方法測(cè)定大鼠腎皮質(zhì)TSP-1、BMP-7、CTGFmRNA表達(dá)，Western blot法檢測(cè)腎組織中TSP-1、BMP-7、CT

10、GF的蛋白表達(dá)。
　　 3.高糖對(duì)HK-2細(xì)胞TSP-1、BMP-7表達(dá)的影響
　　 將細(xì)胞分為正常糖對(duì)照組（NG培養(yǎng)于含5.5mmol/LD-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基）、高糖組（HG培養(yǎng)于含25mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基）、高滲組（MG培養(yǎng)于含25mmol/L甘露醇），并于培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后終止培養(yǎng)。用甲基噻唑基四唑（MTT）法觀察不同時(shí)間（24、48、72h）高糖對(duì)細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。RT-PCR

11、檢測(cè)各組HK-2 TSP-1、CTGF、BMP-7、α-SMA mRNA的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清液FN的含量，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)TSP-1、CTGF、BMP-7、FN、α-SMA，Western-blot法測(cè)定TSP-1、BMP-7、CTGF、α-SMA蛋白表達(dá)。
　　 4.RSG對(duì)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞TSP-1、BMP-7表達(dá)影響的干預(yù)研究
　　 將細(xì)胞分為正常糖對(duì)照組（NG培養(yǎng)于含5

12、.5mmol/Ld-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基）、高糖組（HG培養(yǎng)于含25mmol/l D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基）、高滲組（MG培養(yǎng)于含25mmol/l甘露醇），RSG干預(yù)組（R5、R10、R20）為分別含RSG5、10、20umol/L的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，用MTT法觀察不同時(shí)間（24、48、72h） RSG對(duì)細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。并于培養(yǎng)48小時(shí)后終止培養(yǎng)。RT-PCR檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞TSP-1、CTGF、BMP-7、α-SMA

13、 mRNA的表達(dá)， ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清液FN的含量，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)TSP-1、CTGF、BMP-7、FN、α-SMA，Western-blot測(cè)定TSP-1、BMP-7、CTGF、α-SMA蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.TSP-1在正常大鼠腎間質(zhì)有微量表達(dá)；隨著DN病理?yè)p傷程度加重，TSP-1在腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)區(qū)表達(dá)增強(qiáng)，使PTC減少，導(dǎo)致慢性腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展。
　　 2.在DN早

14、期BMP-7水平的下降，提示BMP-7的降低可能參與了早期DN的發(fā)病，其在腎小管表達(dá)的變化提示DN早期可能已有腎小管間質(zhì)受損。
　　 3.伴隨TSP-1表達(dá)的增加，BMP-7呈遞減趨勢(shì)，提示BMP-7可能在DN中具有與TSP-1相反的作用，即抑制腎臟纖維化的作用。
　　 4.RSG能保護(hù)糖尿病大鼠的腎臟損傷。其可能機(jī)制包括減少TSP-1表達(dá)，抑制TGFβ-1下游效應(yīng)因子CTGF的表達(dá)，增加抗纖維化抗炎作用的BMP-7表達(dá)