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1、目的:
糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是導(dǎo)致終末期腎病(end stage renaldisease,ESRD)最主要的原因之一。關(guān)于DN進(jìn)展機(jī)制尚未完全闡明,近年研究認(rèn)為腎小管間質(zhì)損傷發(fā)揮重要作用,與DN預(yù)后直接相關(guān)。而腎小管上皮細(xì)胞衰老作為腎小管間質(zhì)損傷重要的細(xì)胞生物學(xué)事件,在DN進(jìn)展中的作用受到廣泛關(guān)注和重視。
DN腎小管上皮細(xì)胞衰老是不依賴于增齡的衰老過程,它是在糖尿病所致的糖脂
2、代謝紊亂、持續(xù)性氧應(yīng)激以及慢性炎癥等病理性微環(huán)境下發(fā)生的應(yīng)激性早衰(stressinduced premature senescence,SIPS)。SIPS是不依賴增齡的細(xì)胞加速衰老,表現(xiàn)為細(xì)胞周期不可逆停滯和增殖能力永久性喪失,導(dǎo)致組織細(xì)胞再生和修復(fù)能力減退,器官功能障礙。衰老細(xì)胞除了SA-β-ga1、p16、p21等特異性分子標(biāo)志外,還可釋放促炎因子、炎癥因子等衰老相關(guān)分泌表型(senescence associated secr
3、etory phenotype,SASP)損害周邊正常細(xì)胞,導(dǎo)致局部組織細(xì)胞炎癥與纖維化。此外,衰老細(xì)胞還具有凋亡抵抗特性可逃逸免疫細(xì)胞清除,導(dǎo)致衰老細(xì)胞堆積滯留,損害效應(yīng)遷延放大,進(jìn)而加速疾病進(jìn)展。研究表明衰老細(xì)胞凋亡抵抗的原因在于誘騙受體(decoy receptor2,DcR2)高表達(dá)。衰老成纖維細(xì)胞因高表達(dá)DcR2而逃逸細(xì)胞凋亡,可導(dǎo)致肝臟組織細(xì)胞纖維化與肝功能受損;前列腺癌等腫瘤細(xì)胞因DcR2表達(dá)水平上調(diào)而呈現(xiàn)凋亡抵抗,導(dǎo)致鄰
4、近正常細(xì)胞惡變和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。此外,在DN大鼠模型中發(fā)現(xiàn)DcR2高表達(dá)可抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡。而關(guān)于DN進(jìn)展中DcR2表達(dá)變化是否與腎組織損傷及腎功能之間有關(guān),以及DcR2表達(dá)變化與衰老腎小管上皮細(xì)胞之間的關(guān)系目前尚不清楚。
本研究首先分析DN腎小管上皮細(xì)胞DcR2、p16表達(dá)變化與腎組織損傷程度及腎功能之間的關(guān)系,然后研究DcR2表達(dá)與衰老腎小管上皮細(xì)胞之間的關(guān)系,并明確衰老腎小管細(xì)胞是否呈現(xiàn)凋亡抵抗表型。通過上述研究,以
5、期明確DcR2在DN進(jìn)展中具有重要作用,并與衰老腎小管上皮細(xì)胞凋亡抵抗密切相關(guān)。以為DN早期干預(yù)衰老腎小管細(xì)胞尋找關(guān)鍵靶分子,并從靶向清除衰老細(xì)胞角度提高DN救治水平和改善腎臟預(yù)后奠定理論基礎(chǔ)。
方法:
1.臨床資料:選取2010-2013年在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腎內(nèi)科住院的2型糖尿病患者36例,并經(jīng)腎活檢病理檢查診斷為DN。根據(jù)腎小管間質(zhì)損傷程度分為早期DN和進(jìn)展期DN,各18例。對(duì)照組腎組織標(biāo)本為在我院住院的腎錯(cuò)
6、構(gòu)瘤或腎臟腫瘤切除術(shù)病灶旁組織經(jīng)病理檢查為正常的組織。采集各組患者的臨床資料及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果,根據(jù)CKD-EPI公式計(jì)算腎小球?yàn)V過率(estimated glomerularfiltration,eGFR)。
2.腎組織損傷程度評(píng)分與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)2010年《美國(guó)腎臟病雜志》發(fā)表的新型病理分級(jí)系統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。按照腎小管萎縮和代償性擴(kuò)張、腎間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎癥程度將DN分為早期DN(early DN)和進(jìn)展期DN(pr
7、ogressive DN)。
3.檢測(cè)指標(biāo)與方法
3.1免疫組化檢測(cè)DcR2、p16表達(dá);
3.2免疫熒光檢測(cè)DcR2、p16、FLIP、caspase-3表達(dá);
3.3利用激光共聚焦觀察DcR2與p16、FLIP、caspase-3之間共表達(dá)情況。
4.結(jié)果判讀方法
結(jié)果的判讀采用雙盲法,由兩名與本研究無關(guān)人員判讀。每張載玻片連續(xù)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野下相關(guān)指標(biāo)陽性表達(dá)的腎小管上
8、皮細(xì)胞(胞核表達(dá))或是腎小管(胞漿表達(dá)),并計(jì)算陽性表達(dá)的腎小管上皮細(xì)胞或腎小管占腎小管細(xì)胞總數(shù)的百分比。共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)DcR2與p16、DcR2與FLIP、DcR2與caspase-3雙陽性腎小管數(shù)及各指標(biāo)單陽性腎小管數(shù)占腎小管總數(shù)百分比。
5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)量資料以(x)±s表示。DN患者的臨床資料及p16、DcR2陽性表達(dá)百分率與對(duì)照組比較,正態(tài)分布資料采用t檢驗(yàn),非正態(tài)分
9、布資料比較采用秩和檢驗(yàn)。腎組織P16、DcR2陽性表達(dá)百分率與臨床資料采用Pearson相關(guān)分析,與腎組織病理損傷程度評(píng)分采用Spearman相關(guān)分析。p<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1.36例DN患者臨床資料特征
36例DN患者中男性17例,女性19例。與對(duì)照組相比,DN組患者收縮壓、尿蛋白定量、尿NAG、尿蛋白/肌酐、糖化血紅蛋白、血肌酐、光抑素C、尿素氮、甘油三酯顯著增高,eGFR顯著降低(P
10、<0.05)。DN組同對(duì)照組年齡、性別、BMI、舒張壓、尿酸、C反應(yīng)蛋白、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.DN腎組織DcR2、p16表達(dá)與臨床資料及腎組織損傷評(píng)分的相關(guān)性
DN中DcR2只表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞,p16可表達(dá)于腎小球細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞與腎間質(zhì)細(xì)胞。正常對(duì)照組腎組織p16、DcR2表達(dá)水平低下。腎小管上皮細(xì)胞DcR2、p16陽性表達(dá)百分率同對(duì)照組相比顯著增
11、高,且進(jìn)展期DN腎小管細(xì)胞上皮DcR2、p16表達(dá)水平較早期DN明顯增加。
DN患者腎組織腎小管上皮細(xì)胞DcR2、p16表達(dá)量與收縮壓、尿蛋白定量、尿NAG、尿蛋白/肌酐、甘油三脂、尿素氮、血肌酐、光抑素C呈正相關(guān),與eGFR呈負(fù)相關(guān),而與年齡、舒張壓、BMI、白蛋白、糖化血紅蛋白、膽固醇、尿酸、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、C反應(yīng)蛋白無相關(guān)性。
DN患者腎組織腎小管上皮細(xì)胞DcR2、p16表達(dá)量與腎組織系膜增生、腎小
12、球硬化、腎間質(zhì)炎癥、腎小管萎縮與間質(zhì)纖維化病變程度顯著相關(guān)。
3.DN腎組織DcR2與p16的共表達(dá)情況
激光共聚焦示DN腎組織中DcR2與p16共表達(dá)于同一腎小管細(xì)胞,共表達(dá)率隨著腎小管間質(zhì)損傷的評(píng)分升高而增加,且DcR2表達(dá)量較p16少??梢娦〔糠謕16與DcR2單陽性腎小管細(xì)胞,且p16單陽性腎小管細(xì)胞百分率較DcR2單陽性腎小管細(xì)胞百分率高,DN各組p16單陽性腎小管細(xì)胞百分率較對(duì)照明顯增高,DcR2單陽性腎
13、小管細(xì)胞在各個(gè)組間比較無顯著差異。
4.DN腎組織DcR2與凋亡相關(guān)標(biāo)志的共表達(dá)情況
激光共聚焦示DcR2與抗凋亡分子FLIP共表達(dá)于同一腎小管細(xì)胞,共表達(dá)率隨著腎小管間質(zhì)損傷的評(píng)分升高而增加。可見小部分FLIP單陽性腎小管細(xì)胞,其百分率較DcR2單陽性腎小管百分率高,F(xiàn)LIP單陽性腎小管細(xì)胞百分率在各組間比較無顯著差異。免疫共染示DcR2陽性的腎小管細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)caspase-3。早期DN中caspase-3
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