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文檔簡介
1、糖尿病(diabetes Mellitus,DM)及其并發(fā)癥嚴重危害人們健康及生存質(zhì)量。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是DM最嚴重的并發(fā)癥之一,也是糖尿病患者重要的死亡原因。較高的血糖水平可以誘導腎小管上皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)成肌成纖維細胞(myofibroblast,MyoF)。MyoF作為組織纖維化的效應細胞,直接參與腎小管間質(zhì)纖
2、維化(tubular interstitialfibrosis,TIF)過程。
“三黃瀉心湯”亦稱“瀉心湯”,出自《金匱要略》,由黃連、大黃、黃芩三味中藥組成,具有瀉火解毒、清熱燥濕、除痞止血之功效,是中醫(yī)臨床治療胃火邪內(nèi)熾證的常用方劑。瀉心湯具有多種藥理作用,現(xiàn)代臨床應用于急性胃腸炎、肝炎、膽囊炎、口腔炎、痢疾以及外科瘡瘍,凡屬心胃火盛者,均可用本方加減治療。目前瀉心湯已臨床應用于糖尿病腎病的治療,但其機制尚未完全闡明。整體
3、動物研究證實,該方具有降低血糖的作用,其抗糖尿病腎病作用是否獨立于降血糖作用值得關注。
本課題擬通過研究瀉心湯有效成分對高糖誘導的腎小管上皮HK-2細胞氧化應激、轉(zhuǎn)分化及遷移的作用,為探討瀉心湯抗糖尿病腎病的物質(zhì)基礎及作用機理提供實驗依據(jù)。
第一部分瀉心湯有效成分對高糖誘導HK-2氧化應激的影響
目的:研究瀉心湯的有效成分大黃酸、小檗堿和黃芩苷對高糖誘導的HK-2細胞抗氧化應激的作用。
方法:體外
4、高糖培養(yǎng)HK-2細胞,藥物處理組加入不同濃度的大黃酸、小檗堿和黃芩苷,孵育24h后收集細胞上清,采用硫代巴比妥酸法檢測MDA的含量,黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活力。
結(jié)果:1、高糖作用HK-2細胞24h后,其上清液中MDA含量比正常組(NG)升高了25.21%(p<0.01),滲透壓對照組(MAN)無明顯變化。藥物干預后,與高糖組(HG)相比,大黃酸2μg/ml、5μg/ml組細胞上清MDA含量分別降低6.16%、18.90%(
5、p<0.05或p<0.01),小檗堿2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml組細胞上清MDA含量分別下降12.24%、20.95%、9.53%(p<0.05或p<0.01),黃芩苷2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml組細胞上清MDA含量分別下降21.45%、15.04%、18.41%(p<0.05或p<0.01)。
2、高糖作用HK-2細胞24h后,細胞上清液中SOD酶活力比NG下降了27.96%(p<0.01),MA
6、N組無明顯變化。藥物干預后,與HG組比相,大黃酸5μg/ml、10μg/ml組SOD酶活力分別升高了21.41%、27.37%(p<0.05或p<0.01),小檗堿2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml組SOD酶活力分別升高了23.15%、28.12%、30.02%(p<0.05或p<0.01),黃芩苷2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml組SOD酶活力分別升高了40.59%、27.35%、38.52%(p<0.01)。
7、 結(jié)論:瀉心湯的三個有效成分大黃酸、小檗堿和黃芩苷均可提高SOD的活性及減少MDA的產(chǎn)生,提示瀉心湯可通過抑制高糖誘導的氧化應激發(fā)揮腎保護作用。
第二部分瀉心湯有效成分對高糖誘導HK-2的轉(zhuǎn)分化作用的影響
目的:研究瀉心湯有效成分大黃酸、小檗堿和黃芩苷對高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞株(HK-2)的轉(zhuǎn)分化作用。
方法:1、體外高糖培養(yǎng)HK-2細胞,藥物處理組加入不同濃度的大黃酸、小檗堿和黃芩苷(2μg/m
8、l、5μg/ml、10μg/ml),孵育48h后western blot法檢測α-SMA蛋白的表達變化。
2、體外培養(yǎng)HK-2細胞,顯微鏡觀察高糖(30mmol/L)及大黃酸、小檗堿、黃芩苷分別為5μg/ml時對細胞形態(tài)的影響。
結(jié)果:1、NG組α-SMA蛋白微量表達, MAN組與NG組相比α-SMA表達未見顯著性差異,高糖刺激48h后α-SMA表達與正常組相比升高了20.03%(p<0.01);與HG組相比,大黃酸
9、(2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)能明顯抑制高糖誘導的α-SMA蛋白表達,分別下降11.67%、13.33%、12.50%(p<0.05或p<0.01);小檗堿(5μg/ml、10μg/ml)能明顯抑制高糖誘導的α-SMA蛋白表達,分別下降10.05%、17.65%(p<0.05或p<0.01);黃芩苷(5μg/ml、10μg/ml)能明顯抑制高糖誘導的α-SMA蛋白表達,分別下降9.09%、11.88%(p<0.05或p<
10、0.01)。
2、正常的HK-2細胞間連接緊密,呈鋪路石樣排列。甘露醇對細胞形態(tài)無明顯影響。高糖刺激48h,細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,拉長為梭形,排列不緊密。大黃酸、小檗堿和黃芩苷組視野下梭形細胞數(shù)目明顯減少,可見鋪路石樣細胞。
結(jié)論:瀉心湯的三個有效成分大黃酸、小檗堿和黃芩苷均可下調(diào)α-SMA蛋白表達,提示瀉心湯可能具有不依賴于調(diào)控血糖的直接腎保護作用。
第三部分瀉心湯有效成分對高糖誘導HK-2遷移的影響
11、r> 目的:研究瀉心湯有效成分對高糖誘導的HK-2細胞遷移的抑制作用和機制。
方法:1、體外高糖培養(yǎng)HK-2細胞,大黃酸、小檗堿和黃芩苷干預10d,transwell實驗檢測細胞遷移能力。
2、體外高糖培養(yǎng)HK-2細胞,藥物處理組加入不同濃度的大黃酸、小檗堿和黃芩苷,western blot方法檢測FAK蛋白表達。
結(jié)果:1、transwell實驗中,與正常組(10.47±1.33細胞數(shù)/視野)相比,滲透
12、壓對照組細胞遷移沒有明顯變化(10.60±1.56細胞數(shù)/視野),高糖刺激10d后細胞遷移顯著增加(66.47±7.29細胞數(shù)/視野,p<0.01),為NG組的6.35倍;大黃酸(5μg/ml)、小檗堿(5μg/ml)、黃芩苷(5μg/ml)能顯著抑制高糖誘導的細胞遷移(45.53±9.72、17.73±3.48、19.93±4.39細胞數(shù)/視野,p<0.05或p<0.01)。
2、與NG組相比,MAN組FAK蛋白表達未見顯著
13、性差異,高糖刺激7d后FAK表達明顯升高了28.73%(p<0.01);與HG組相比,大黃酸組FAK蛋白表達無明顯變化;小檗堿5μg/ml、10μg/ml組FAK蛋白表達分別降低22.18%、26.59%(p<0.05或p<0.01);黃芩苷5μg/ml、10μg/ml組FAK蛋白表達分別降低25.18%、22.93%(p<0.01)。
結(jié)論:瀉心湯的三個有效成分大黃酸、鹽酸小檗堿和黃芩苷均可抑制高糖誘導HK-2細胞遷移,提示
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