銜接蛋白p66Shc對糖尿病腎病腎小管上皮細胞氧化損傷及凋亡的影響與機制研究.pdf

1、研究背景：糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是終末期腎臟疾病(end stage renal disease,ESRD)的最常見原因之一。約30％-40％Ⅰ型糖尿病，15％Ⅱ型糖尿病最終將進展為ESRD。大量臨床研究表明，未控制的高血糖是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，但其作用機制仍不清楚。有研究表明，活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)在高血糖誘導的細胞損傷中起重要作用。高血糖造成

2、腎臟ROS生成增加，ROS可活化信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)效應（如PKC、MAPK、JAK/STAT等），又可作為胞內(nèi)信號激活某些轉(zhuǎn)錄因子（如NFκB、內(nèi)皮素－1等），導致TGF-β1等表達增加。上述信號分子進一步誘導ROS產(chǎn)生，不斷放大高糖造成的細胞損傷，導致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成增加、基底膜增厚、系膜擴張，最終導致進行性的腎小球硬化和腎小管萎縮，引起腎功能下降和衰竭。盡管高糖造成細胞ROS產(chǎn)生增加已得到

3、公認，但ROS產(chǎn)生的具體機制至今仍未闡明。
　　 Src同源區(qū)2結(jié)構(gòu)域蛋白C(SHC)家族成員ShcA基因編碼3種蛋白，分子量分別為46，52和66kDa(p46、p52和p66）。p66Shc是哺乳動物生命周期相關(guān)的蛋白，也是近年來研究細胞氧化應激的主要蛋白之一，敲除p66Shc基因可以使小鼠的壽命延長30％。大量研究表明，p66Shc在衰老及其相關(guān)的疾病中起關(guān)鍵作用，其共同機制為p66Shc的缺失加強了機體對氧化應激的抵抗。

4、研究表明，p66Shc主要定位于胞漿，小部分(10％-40％)與線粒體熱休克蛋白70(mHSP70)及線粒體內(nèi)、外膜轉(zhuǎn)移酶(TIM/TOM)形成復合物，定位于線粒體膜間隙。在正常情況下，p66Shc是失活的，不影響線粒體的功能，線粒體內(nèi)的p66Shc只有在某些信號的作用下(p53/H2O2/UV等）才能解聚形成有活性的單體。另外，這些信號又可活化PKCβ，使胞漿內(nèi)的p66Shc磷酸化，磷酸化的p66Shc可被脯氨酰異構(gòu)酶(prolyli

5、somerase 1,pinl)識別從而異構(gòu)化，進而在蛋白磷酸酶2A(Protein Phosphatase 2A，PP2A)的作用下去磷酸化進入線粒體，在線粒體內(nèi)氧化細胞色素C產(chǎn)生ROS，開放線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)，增加膜通透性，使大量離子、溶質(zhì)和水涌入線粒體，導致線粒體水腫及形態(tài)/功能改變（包括降低鈣離子反應和線粒體3D結(jié)構(gòu)的改變）；同時，

6、促凋亡因子如細胞色素C(cytochrome C)通過開放的mPTP釋放到胞漿，激活caspases，導致細胞凋亡。
　　 研究顯示p66Shc與糖尿病產(chǎn)生的氧化應激及其造成的血管損傷密切相關(guān)。有學者發(fā)現(xiàn)Ⅱ型糖尿病病人外周血單核細胞p66Shc表達較正常人明顯升高，其水平與血漿8-Isoprostane（一個氧化應激標記物）水平呈正相關(guān)。Menini等的體內(nèi)實驗也發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)敲除p66Shc基因，可以減少STZ誘導的Ⅰ型糖尿

7、病腎病腎組織產(chǎn)生的氧化應激，保護腎臟組織結(jié)構(gòu)和功能，改善腎組織病理變化，降低蛋白尿，抑制NFκB的活性，降低AGE的形成。上述研究均提示p66Shc與糖尿病及糖尿病腎病進展密切相關(guān)。但具體的機制尚不清楚。基于以上分析，我們認為p66Shc可能與糖尿病腎病細胞凋亡及ROS產(chǎn)生有關(guān)，為此，本實驗開展如下的研究。
　　 第一章、p66Shc在STZ誘導的Ⅰ型糖尿病腎病大鼠腎組織中的表達及其與氧化損傷的關(guān)系
　　 目的：利用ST

8、Z誘導的糖尿病大鼠模型，觀察腎組織中p66Shc的表達變化，并探討p66Shc與腎組織氧化損傷的關(guān)系。
　　 方法：本實驗分糖尿病組（STZ組）和正常對照組（Con組），每組10只雄性SD大鼠，體重190-220克。采用一次性腹腔注射STZ60mg/kg的方法建立Sprague-Dawley(SD)大鼠糖尿病模型（對照組注射等量PBS）。實驗前檢查隨機血糖＞16.7mmol/L，入選為糖尿病組。第8周處死大鼠，取腎組織。采用HE

9、、Masson染色觀察腎臟病理改變；DHE染色檢測組織活性氧簇(ROS)；免疫組化、Westemblot方法檢測腎臟p66Shc表達變化，并分析p66Shc表達與腎組織氧化損傷的關(guān)系。
　　 結(jié)果：SD大鼠腹腔注射STZ后72小時，大鼠隨機血糖＞16.7mmol/L，4周后測尿蛋白在30mg/24h以上，表明DN模型制備成功。糖尿病組大鼠血糖升高，出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿等癥狀，與對照組比較，體重明顯減輕；同時，腎臟體積明顯增大

10、，腎重明顯增加。
　　 與對照組比較，STZ組大鼠腎組織腎小球體積增大，部分小球可見細胞數(shù)目增多，腎小球系膜基質(zhì)增多；近端小管上皮細胞刷狀緣減少或消失，部分腎小管萎縮和脫落、腎小管上皮細胞空泡樣變性。
　　 對照組大鼠腎組織僅部分細胞胞核內(nèi)表達極微弱的DHE紅色熒光，STZ組大鼠腎組織大量細胞胞核內(nèi)可見明顯的紅色熒光，較對照組顯著增強，提示糖尿病腎病腎組織ROS產(chǎn)生增加。
　　 免疫組化結(jié)果顯示：p66Shc在對

11、照組大鼠腎組織有少量表達；糖尿病組大鼠的腎組織特別是腎小管中p66Shc表達顯著增強。Westernblot結(jié)果顯示：糖尿病組大鼠腎組織p66Shc蛋白的表達顯著升高，與對照組比較有顯著差異。
　　 結(jié)論：糖尿病狀態(tài)下，大鼠腎臟特別是腎小管p66Shc表達顯著增加；p66Shc表達增加的同時伴隨腎組織ROS的大量產(chǎn)生，提示p66Shc可能在糖尿病腎病ROS的產(chǎn)生過程中起重要作用。
　　 第二章、高葡萄糖對腎小管上皮細胞p

12、66Shc表達和磷酸化的影響
　　 目的：探討高葡萄糖對腎小管上皮細胞p66Shc蛋白表達及其第36位絲氨酸磷酸化的影響。
　　 方法：用不同濃度D-葡萄糖(5.5mM,15mM，30mM,45mM)處理正常人近端腎小管上皮細胞株（D-甘露醇作為等滲對照組），在不同時間點提取細胞RNA和蛋白，采用realtime-PCR檢測p66ShcmRNA的表達變化，Westemblot檢測p66Shc蛋白、磷酸化p66ShcSer

13、36蛋白的表達。
　　 結(jié)果：HK-2細胞經(jīng)不同濃度D-葡萄糖處理后，p66Shc蛋白表達逐漸增高，呈濃度依賴模式；其中45mM葡萄糖處理后，p66Shc蛋白表達最強；等滲對照組p66Shc表達與正常對照組比較無顯著性差異。
　　 HK-2細胞經(jīng)30mM葡萄糖處理后，p66ShcmRNA表達逐漸增高，呈時間依賴模式，p66ShcmRNA在24h表達最強；p66Shc蛋白表達的結(jié)果與mRNA的結(jié)果相一致，在48h表達最強。

14、
　　 HK-2細胞經(jīng)30mM葡萄糖處理后，15min磷酸化p66ShcSer36的表達即明顯增加，90min達最高峰，之后逐漸降低，但在180min仍高于0min組。
　　 結(jié)論：人近端腎小管細胞株HK-2表達p66Shc；高葡萄糖呈時間和濃度依賴模式上調(diào)HK-2p66Shc的表達；高葡萄糖促進p66ShcSer36磷酸化。
　　 第三章、p66Shc通過線粒體途徑調(diào)控高葡萄糖誘導的腎小管上皮細胞氧化損傷和凋亡

15、
　　 目的：探討銜接蛋白p66Shc對高糖誘導的腎小管上皮細胞氧化損傷及凋亡的影響及其作用機制。
　　 方法：常規(guī)培養(yǎng)正常人近端腎小管上皮細胞株(HK-2)，分別用質(zhì)粒pcDNA3.1hisp66Shc和pcDNA3.1hisp66ShcS36A（第36位絲氨酸突變?yōu)楸彼幔┺D(zhuǎn)染HK-2細胞，建立穩(wěn)定表達的細胞株。隨后將細胞分為4組：1)未轉(zhuǎn)染HK-2＋5.5mM葡萄糖（正常對照組）；2)未轉(zhuǎn)染HK-2＋30mM葡萄糖

16、（高糖組）；3)轉(zhuǎn)染p66ShcWT的HK-2＋30mM葡萄糖(p66Shc組）；4)轉(zhuǎn)染p66ShcS36A的HK-2＋30mM葡萄糖（S36A組）。采用AnnexinV和Hoechst33258染色檢測細胞凋亡；MitoSoxRed染色檢測細胞線粒體ROS含量；TMRE染色檢測線粒體膜電位；Westemblot檢測procaspase9、線粒體cytochromec及線粒體p66Shc在HK-2細胞的表達；提取線粒體DNA，PCR檢

17、測線粒體DNA的損傷；LDH檢測試劑盒檢測細胞上清液LDH的水平；TBA法檢測細胞上清液MDA的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.p66Shc細胞株鑒定：轉(zhuǎn)染p66ShcWT和p66ShcS36A質(zhì)粒的HK-2細胞p66Shc的表達較未轉(zhuǎn)染的HK-2細胞顯著增高。
　　 2.在高葡萄糖作用下，p66Shc在線粒體內(nèi)聚集；p66Shc過表達增加高糖導致的細胞凋亡和線粒體ROS的產(chǎn)生；加重高糖導致的細胞線粒體膜電位下降