p66Shc特異性慢病毒載體的構建及其對高氧誘導肺泡上皮細胞凋亡的影響.pdf

1、目的:構建p66Shc特異性慢病毒載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人肺泡Ⅱ型上皮A549細胞中，抑制p66Shc的表達，并探討其對高氧誘導肺泡上細胞凋亡的影響。
　　方法:設計3條p66ShcRNA干擾靶點，合成雙鏈DNA，與雙酶切后的慢病毒空載體進行連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的細胞，鑒定陽性克隆正確后，抽提、擴增質(zhì)粒，與另外3個輔助包裝質(zhì)粒進行慢病毒包裝，測定滴度后感染A549細胞，選取沉默效應最為明顯的p66Shc-Shc1組進入后續(xù)實驗，穩(wěn)定培養(yǎng)一

2、個月。同時體外傳代培養(yǎng)慢病毒空載體感染的A549細胞及未做任何處理的A549細胞。將實驗細胞分為四組:對照組，高氧組，慢病毒+高氧組，空載體+高氧組。對照組:在含10％胎牛血清和1％青鏈霉素的1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng);高氧組、慢病毒+高氧組、空載體+高氧組:加入等量的上述培養(yǎng)液，換液后，以3L/min的速度通入含95％氧氣的高純混合氣10min，后在培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后收集細胞檢測指標:倒置相差顯微鏡下觀察A549細胞的形態(tài)學改

3、變;流式細胞術檢測高氧及慢病毒載體對細胞凋亡的影響;SP細胞免疫化學方法檢測分組24小時后XIAP，Caspase-9蛋白的表達;激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體活性氧產(chǎn)生情況及膜電位變化情況。
　　結果:(1) p66Shc-pLenR-GPH載體的鑒定:將重組質(zhì)粒及pLenR-GPH空載體以限制性內(nèi)切酶雙酶切后行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果與預期相符，LV-shRNA載體構建成功。(2)慢病毒的包裝:將所構建的p66Shc-pLenR-

4、GPH重組質(zhì)粒及pLenR-GPH空載體與輔助包裝質(zhì)粒pRsv-REV， pMD1g-pRRE，pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染終止24小時后在熒光倒置顯微鏡下觀察，每孔細胞均表達GFP綠色熒光，轉(zhuǎn)染成功。(3)穩(wěn)定沉默p66Shc基因的A549細胞系的建立:將濃縮后的病毒感染A549細胞，對感染后的A549細胞做熒光定量PCR及Western blot，3組細胞p66ShcRNA表達量降低，p66Shc蛋白的表達下降，p66Shc-

5、Shc1組下降更為明顯，表明我們已經(jīng)成功建立了穩(wěn)定沉默p66Shc的A549細胞系，并選取p66Shc-Shc1組進入后續(xù)實驗。(4)倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學改變:對照組細胞貼壁良好，呈鋪路石樣，為典型扁圓多角形，數(shù)量多，排列緊密，懸浮細胞少。高氧組及空載體+高氧組細胞隨時間延長，懸浮細胞數(shù)量增多，貼壁細胞生長緩慢，細胞形態(tài)由典型的扁圓多角形變成圓形或橢圓形，數(shù)量減少，連接松散，細胞間隙可見較多細胞碎片。慢病毒+高氧組細胞生長狀

6、態(tài)欠佳，部分細胞形態(tài)由典型的扁圓多角形變成圓形或橢圓形，活細胞數(shù)量較高氧組增多，懸浮細胞數(shù)量較高氧組少，但未達到對照組水平;(5)流式細胞術檢測凋亡:與對照組相比，高氧組及空載體+高氧組細胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。而慢病毒+高氧組的凋亡率有所降低，與高氧組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05）;(6)免疫組織化學方法檢測凋亡相關蛋白的表達:與對照組相比，高氧組及空載體+高氧組細胞內(nèi)XIAP表達減少，Caspase

7、-9蛋白的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。而與高氧組相比，慢病毒+高氧組細胞內(nèi)XIAP表達增加，Caspase-9蛋白的表達有明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）;(7)激光共聚焦顯微鏡結果:與對照組相比，高氧組細胞線粒體活性氧含量顯著增加，膜電位明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05）。而與高氧組相比，慢病毒+高氧組細胞線粒體活性氧含量顯著減少，膜電位明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，但未達到對照組水