HMGA2及l(fā)et-7d miRNA對糖尿病腎臟病腎小管上皮細胞轉分化及腎臟纖維化的調控.pdf

1、背景和目的:
　　TGFβ1誘導的腎小管上皮間質轉化(EMT)在糖尿病腎臟病(DKD)腎纖維化中起關鍵作用，HMGA2被報道通過多重機制參與TGFβ1誘導的EMT的發(fā)生過程。微小RNA(miRNA)作為重要的轉錄后水平調控因子也參與EMT的發(fā)生。既往對TGFβ1/HMGA2在EMT中的研究多集中于腫瘤或其他器官領域，而在DKD背景下，尤其是在腎小管上皮細胞EMT及纖維化進程中的作用目前并不明確。本研究擬探討HMGA2對TGFβ1誘

2、導的腎小管上皮細胞EMT及纖維化過程的影響和作用，并進一步針對靶基因HMGA2，研究其上游miRNA對HMGA2的影響及參與DKD腎纖維化的潛在作用機制。通過上述研究，將有助于我們據此針對有效的信號通路發(fā)現重要的干預和治療靶點，從而為DKD腎纖維化的治療提供新的思路。
　　方法:
　　1.建立TGFβ1刺激大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）的細胞模型，利用qRT-PCR及western blot的方法檢測TGFβ1刺激前后

3、HMGA2及EMT相關基因的表達變化。
　　2.利用siRNA轉染的方法驗證HMGA2在TGFβ1誘導的EMT及腎纖維化中的作用，用qRT-PCR及western blot檢測siRNA沉默HMGA2基因前后其下游轉錄因子的表達變化。
　　3.通過生物信息學方法，針對靶基因HMGA2篩選有價值的上游miRNA，用qRT-PCR檢測TGFβ1誘導NRK-52E細胞前后各miRNA的表達差異，同時進一步于UUO小鼠模型中探索HM

4、GA2及其上游miRNA的表達變化。
　　4.通過過表達（轉染miRNA mimics）和抑制(轉染miRNA inhibitors)的功能實驗進一步驗證篩選出的miRNA對TGFβ1誘導的EMT和腎纖維化的影響和作用。用qRT-PCR及western blot檢測HMGA2及EMT相關因子于miRNA過表達及抑制前后的表達情況。
　　結果:
　　1.qRT-PCR及western blot結果表明:給予10ng/mL

5、 TGFβ1刺激NRK-52E細胞48h后，與Control組比較，TGFβ1(48h)組中HMGA2、α-SMA、vimentin、Col-Ⅰ及FN的表達均明顯升高，E-Cad的表達明顯降低。
　　2.qRT-PCR及western blot結果表明:轉染siRNA-HMGA2能明顯抑制TGFβ1誘導的NRK-52E細胞中HMGA2及α-SMA、vimentin表達的上調以及E-Cad表達的下調;轉染siRNA-HMGA2對其下

6、游轉錄因子Snail，Slug和Twist的表達無明顯影響。
　　3.針對靶基因HMGA2，篩選出有價值的上游miRNA: miRNA-let-7d、miRNA-98、miRNA-33; qRT-PCR結果顯示:miRNA-let-7d在TGFβ1誘導的NRK-52E細胞及UUO小鼠腎臟中的表達均明顯降低，而HMGA2的表達則呈反向升高;TGFβ1的刺激對miRNA-98及miRNA-33的表達無明顯影響。
　　4.qRT-

7、PCR及western blot結果表明:轉染let-7d mimic能明顯抑制TGFβ1誘導的NRK-52E細胞中HMGA2及α-SMA、Col-Ⅰ、FN表達的上調以及E-Cad表達的下調;轉染let-7d inhibitor能明顯增強TGFβ1誘導的HMGA2及Col-Ⅰ、FN表達的上調以及E-Cad表達的下調。
　　結論:
　　1.TGFβ1可誘導NRK-52E細胞中HMGA2的高表達，并使細胞發(fā)生EMT及纖維化改變。

8、
　　2.對HMGA2進行基因沉默(siRNA-HMGA2)可逆轉TGFβ1誘導的EMT及纖維化改變，它是一個重要的靶基因。
　　3.miRNA-let-7d為HMGA2重要的上游miRNA，miRNA-let-7d/HMGA2在TGFβ1誘導的EMT及腎纖維化進程中可能發(fā)揮作用。
　　4.過表達miRNA-let-7d可下調HMGA2的表達，進而抑制TGFβ1誘導的EMT及腎纖維化改變;抑制miRNA-let-7d可