甲型副傷寒STF口服制劑的制備和檢定.pdf

1、目的：初步研制一種用于緊急預(yù)防和輔助治療甲型副傷寒的新型生物制劑，并探索其制備工藝。
　　 方法：(1)體內(nèi)免疫法制備甲型副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子(PA-STF):制備甲型副傷寒沙門菌(SPA)免疫原，采取皮下多點(diǎn)注射免疫山羊，免疫成功后分別取脾臟和淋巴結(jié)制備PA-STF。(2)體外免疫法制備PA-STF:采用SPA體外免疫脾細(xì)胞技術(shù)，探索PHA刺激的合適劑量、免疫原最佳濃度及最佳作用時(shí)間、免疫羊脾細(xì)胞最適培養(yǎng)時(shí)間，按優(yōu)化條件培養(yǎng)羊

2、脾細(xì)胞，制備PA-STF。(3) PA-STF的理化性質(zhì)檢定：采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行多波長掃描，以苔黑酚法和改良Lowry法分別檢測PA-STF的核糖及多肽含量，并進(jìn)行無菌試驗(yàn)、熱原質(zhì)試驗(yàn)和安全試驗(yàn)等。(4) PA-STF的免疫學(xué)活性檢定：取昆明小鼠，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、對(duì)照1組、對(duì)照2組和NS組，分別以體內(nèi)法制備的PA-STF、體外法制備的PA-STF、體內(nèi)法制備的非特異性轉(zhuǎn)移因子(nTF)、體外法制備的nTF、生理鹽水灌胃，

3、采用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、白細(xì)胞粘附抑制試驗(yàn)(LAIT)、吞噬細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)、吞噬細(xì)胞殺菌功能試驗(yàn)和免疫保護(hù)性試驗(yàn)等檢定PA-STF的免疫學(xué)活性。免疫保護(hù)性試驗(yàn)中，SPA攻擊后第4天仍然存活的小鼠，取5只觀察攻擊后2周時(shí)的一般情況，剩余小鼠在攻擊后第7天處死，剪取3cm的回腸用4%甲醛固定后，HE染色，鏡檢，觀察腸粘膜的病理學(xué)改變。
　　 結(jié)果：(1)以淋巴結(jié)制備的PA-STF的多肽濃度為1.83±0.17mg/ml，核糖濃度為0

4、.572±0.024mg/ml，以脾臟制備的PA-STF的多肽濃度為1.59±0.22 mg/ml，核糖濃度為0.493±0.015mg/ml，兩者相比，多肽之間及核糖之間濃度沒有顯著差異(P>0.05)。(2)100μg/ml的PHA與脾細(xì)胞培養(yǎng)6h后，加入0.2ng/ml的SPA免疫原，繼續(xù)培養(yǎng)至96h條件下制備的PA-STF的多肽和核糖的含量，明顯高于其他劑量、時(shí)間等條件下制備的PA-STF(P<0.05)。(3)兩種方法制備的P

5、A-STF的氨基酸、多肽、核糖的含量無顯著性差異(P>0.05)，無菌試驗(yàn)均為陰性，熱原質(zhì)試驗(yàn)和安全試驗(yàn)均合格。(4)兩種方法制備的PA-STF在多肽濃度為0.60mg/ml時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)(SI)明顯高于其它濃度時(shí)的SI(P<0.05)；兩實(shí)驗(yàn)組的LAIR均高于兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩實(shí)驗(yàn)組之間比較，LAIR無顯著性差異(P>0.05)；吞噬細(xì)胞的吞噬功能和殺菌功能試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間以及兩實(shí)驗(yàn)組之

6、間比較，吞噬率和殺菌率均無顯著性差異(P>0.05)，各組吞噬率與殺菌率的相關(guān)系數(shù)均大于0.8；免疫保護(hù)性試驗(yàn)中，兩實(shí)驗(yàn)組分別與兩對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠存活率均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，兩實(shí)驗(yàn)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組存活小鼠2周時(shí)一般情況明顯好于其它組，且病理學(xué)結(jié)果顯示小鼠回腸粘膜的炎性程度較其它組輕。
　　 結(jié)論：(1)體內(nèi)免疫法成功制備PA-STF，脾臟和淋巴結(jié)均可作為制備原料；體外免疫法成功制備