長(zhǎng)期傳代的TGEV CN12株全基因組遺傳變異及qPCR檢測(cè)方法的研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎（Transmissible Gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）引起的急性、高度接觸性腸道疾病，以仔豬嘔吐、水樣腹瀉和脫水為主要特征，是引發(fā)規(guī)?；i場(chǎng)病毒性腹瀉的主要病原之一，不同品種和不同日齡的豬只均易感染，但2日齡內(nèi)的仔豬死亡率最高。成豬死亡率雖低，但會(huì)提高料肉比，增加飼養(yǎng)成本，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2、該病于1946年在美國(guó)首次報(bào)道，此后迅速在許多國(guó)家發(fā)生和流行，我國(guó)在二十世紀(jì)60年代首次在臺(tái)灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病，隨后陸續(xù)在大陸數(shù)省發(fā)現(xiàn)該病存在，近年來(lái)其危害程度日趨加深，嚴(yán)重影響了我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。所以研究該病的流行與變異情況，并建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是十分有必要的。
　　本研究利用PK-15細(xì)胞從華南地區(qū)某豬場(chǎng)腹瀉仔豬小腸病料中分離、鑒定為豬傳染性胃腸炎病毒，并命名為T(mén)GEV CN12株。該病毒經(jīng)PK-15細(xì)胞系體外連

3、續(xù)培養(yǎng)至120代，并對(duì)CN12株F5與F80兩代次進(jìn)行全基因組序列的測(cè)定，利用生物軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理與分析，為以后開(kāi)展該病毒在致病性、診斷防控以及分子生物學(xué)方面的研究提供了一定的參考依據(jù)。
　　病毒分離鑒定結(jié)果顯示：CN12株在盲傳3代后開(kāi)始出現(xiàn)比較明顯的細(xì)胞病變，隨著代次的增加，CPE出現(xiàn)時(shí)間縮短并趨于穩(wěn)定。測(cè)定其F5、F20、F40、F60、F80、F100、F120七個(gè)代次的TCID50分別為10-4.25/0.1mL、

4、10-5.23/0.1mL、10-5.67/0.1mL、10-5.89/0.1mL、10-6.67/0.1mL、10-7.33/0.1mL、10-7.26/0.1mL。序列分析發(fā)現(xiàn)：與國(guó)內(nèi)外TGEV參考毒株比較分析發(fā)現(xiàn)，CN12株在ORF3a基因上存在140個(gè)連續(xù)堿基的缺失，與華毒株（疫苗株）有明顯區(qū)分，可確定本分離毒株為野毒株，但它與華毒株H以及Miller株同源性較高，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示親緣關(guān)系較近。與F5代次相比，CN12株F80在全

5、基因組上并未發(fā)現(xiàn)任何的插入、缺失等現(xiàn)象，只存在6個(gè)核苷酸的突變并導(dǎo)致4個(gè)氨基酸變異。
　　為了建立一種針對(duì)TGEV的快速、精確、敏感、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，本研究參考國(guó)內(nèi)外最新檢測(cè)技術(shù)研究的進(jìn)展，設(shè)計(jì)一對(duì)TGEV S基因上的保守區(qū)引物，通過(guò)不斷的優(yōu)化反應(yīng)條件，初步建立了一套完善的TGEV SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程式為Ct=-3.279 lgx+37.920，其中，R2=0.99845，E=1.0

6、2，表明試驗(yàn)可信度高，反應(yīng)體系較好；熔解曲線的Tm值83.5～84.0℃之間，峰圖較為單一，并無(wú)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)，表明本方法特異性比較高；特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，只有TGEV出現(xiàn)熒光信號(hào)并呈現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線，表明此方法特異性較好；本次試驗(yàn)可以檢出的最低模板拷貝數(shù)達(dá)到25 copies/μL，比常規(guī)RT-PCR敏感度高約100倍；批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示的CV值均小于3％，表明本方法誤差小，重復(fù)性高；臨床樣品的檢測(cè)中，本方法檢出的陽(yáng)性