2014-2015年河南省PRRSV的分子檢測(cè)、變異分析及HP-PRRSV分離株全基因組序列分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一種以妊娠母豬的繁殖障礙以及仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病為特征的高度接觸性傳染病，新生仔豬死亡率較高，并可引起免疫抑制及持續(xù)性感染。自我國(guó)首次報(bào)道PRRS至今，該病已歷經(jīng)20年的

2、流行及演變，特別是2006年我國(guó)暴發(fā)高致病性PRRS（HP-PRRS），給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2008年，美國(guó)分離到PRRSV變異株NADC30，與北美經(jīng)典毒株VR2332相比，其Nsp2蛋白存在131個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失。2012年以來(lái)，具有相同缺失特征的類NADC30毒株已在我國(guó)13個(gè)省市相繼出現(xiàn)，且與國(guó)內(nèi)PRRSV流行毒株發(fā)生重組。PRRSV具有高度變異的特點(diǎn)，導(dǎo)致毒株多樣性顯著，不同毒株在抗原性及致病性等方面存在一定差異，

3、這也正是PRRS難以防控和消除的重要原因之一。
　　本研究旨在通過對(duì)河南省PRRSV流行毒株進(jìn)行分子檢測(cè)及NSP2、ORF5基因的變異分析，并對(duì)流行毒株進(jìn)行分離鑒定及全基因序列測(cè)定與分析，了解其部分生物學(xué)特性、分子變異特征和遺傳進(jìn)化情況，揭示河南地區(qū)PRRSV最新流行動(dòng)態(tài)及變異趨勢(shì)，以期為PRRS臨床診斷、疫情預(yù)警、新型疫苗及抗病毒藥物的研發(fā)提供科學(xué)的參考依據(jù)。
　　1.2014-2015年河南省PRRSV的分子檢測(cè)及NSP

4、2、ORF5基因變異分析
　　為了解河南省PRRSV流行毒株的分子特征及變異情況，本試驗(yàn)對(duì)2014-2015年采自河南各地165個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的414份疑似PRRS的臨床樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，并對(duì)PRRSV陽(yáng)性樣品的NSP2和ORF5基因進(jìn)行測(cè)序及比對(duì)分析。結(jié)果顯示，共檢出PRRSV陽(yáng)性樣品123份，陽(yáng)性率為29.7％；擴(kuò)增得到50個(gè)NSP2和64個(gè)ORF5基因序列；遺傳進(jìn)化分析表明，河南地區(qū)PRRSV流行毒株主要為美洲型毒株，其中

5、40株與美洲毒株NADC30高度同源，且該類毒株NSP2蛋白存在131個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失，與國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道一致；其余21株與我國(guó)HP-PRRSV代表性毒株JXA1高度同源。與2012-2013年相比，2014-2015年河南地區(qū)PRRSV流行毒株以類NADC30毒株為優(yōu)勢(shì)毒株，其在流行毒株中所占比例急劇上升；大多數(shù)HP-PRRSV毒株與疫苗株JXA1-P80親緣關(guān)系較近，且PRRSV流行毒株的NSP2和ORF5基因均發(fā)生較大變異，提示

6、弱毒疫苗的廣泛使用及引種數(shù)量劇增可能是造成PRRSV優(yōu)勢(shì)流行毒株在河南地區(qū)發(fā)生改變并迅速擴(kuò)散的重要原因之一。因此有必要對(duì)PRRSV的流行和變異進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)，并對(duì)其致病性等方面進(jìn)行深入研究，以期為臨床診斷和疫病防控提供科學(xué)的參考依據(jù)。
　　2.4株HP-PRRSV毒株的分離與鑒定
　　將檢測(cè)結(jié)果為PRRSV陽(yáng)性的組織樣品接種Marc-145細(xì)胞，通過連續(xù)傳代進(jìn)行病毒分離，并利用RT-PCR及間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）對(duì)分離毒株

7、進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，從52份陽(yáng)性樣品中成功分離到4株HP-PRRSV，分別命名為HENZK-1、HENPDS-2、HENZMD-5和HENXC-1，其第5代細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒含量分別為105.77TCID50/mL、106.75TCID50/mL、104.80TCID50/mL和104.36TCID50/mL。本試驗(yàn)為研究PRRSV流行毒株的致病性及遺傳進(jìn)化等方面奠定了基礎(chǔ)。
　　3.HP-PRRSV毒株HENZK-1和HENPDS

8、-2全基因組序列的測(cè)定與分析
　　利用RT-PCR方法對(duì)分離株HENZK-1和HENPDS-2株全基因組進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序與分析。結(jié)果顯示，HENZK-1和HENPDS-2株全基因組長(zhǎng)度分別為15019bp和15020bp，不含Poly(A)尾。序列比對(duì)分析顯示，2個(gè)分離株Nsp2蛋白均存在30個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失，具有HP-PRRSV毒株的遺傳特征，同時(shí)還存在新的變異。核苷酸序列的同源性及遺傳進(jìn)化分析表明，2個(gè)分離株與HP-PRRS

9、V代表性毒株JXA1各代次致弱毒株（JXA1-P10~P170）及其3個(gè)疫苗返強(qiáng)毒株NT1、NT2和NT3的同源性分別為99.3%~99.4%和99.6%~99.8%，屬于以JXA1為代表的亞群，且分布于同一個(gè)進(jìn)化分支，與JXA1-P45和NT2親緣關(guān)系較近，提示HENZK-1和HENPDS-2可能為疫苗返強(qiáng)毒株，回歸動(dòng)物試驗(yàn)初步結(jié)果表明它們具有明顯的致病性。本試驗(yàn)為深入研究HP-PRRSV毒株的遺傳演變規(guī)律及毒力等奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為

10、疫病防控和疫苗研發(fā)及使用提供了科學(xué)的參考依據(jù)。
　　4.PRRSV類NADC30毒株HENXX-1全基因組序列的測(cè)定與分析
　　利用RT-PCR方法對(duì)河南流行株HENXX-1株全基因組進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序與分析。結(jié)果顯示，HENXX-1株全基因組長(zhǎng)度為15019bp，不含Poly(A)尾。核苷酸序列的同源性分析顯示，其與NADC30的同源性為96.0%，與VR-2332、CH-1a和JXA1的同源性分別為85.3%、84.6%和8