家貓血管緊張素轉換酶2基因的cDNA克隆、表達、生物信息學分析及其組織分布研究.pdf

1、血管緊張素轉換酶2(angiotensin-convertingenzyme2，ACE2)是一種金屬蛋白酶，它廣泛存在于人及動物的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、睪丸以及腸道等主要器官中，在調(diào)節(jié)心臟、腎臟功能及控制血壓中起到非常關鍵的作用，也有研究報道ACE2基因參與糖尿病腎病的病理發(fā)展，同時在睪丸組織的特異性表達被認為可能也參與了生殖能力的調(diào)節(jié)。最近發(fā)現(xiàn)，ACE2是嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒(severeacuterespiratorys

2、yndromeassociatedcoronavirus，SARS-CoV)的功能性受體。 SARS-CoV的纖突(Spike，S)蛋白能特異識別靶細胞上的ACE2蛋白并與之結合，從而介導病毒侵入靶細胞。業(yè)已發(fā)現(xiàn)除了人以外，恒河猴、果子貍、家貓、雪貂都是SARS-CoV的易感動物，小鼠、大鼠、果子貍等動物的ACE2同樣能介導SARS-CoV感染細胞。有研究表明，多種Ⅰ和Ⅲ型冠狀病毒都能夠利用家貓中的特異受體從而侵入靶細胞。這些現(xiàn)

3、象都說明家貓有可能在冠狀病毒跨種感染以及新冠狀病毒的衍生過程中起到重要作用。ACE2蛋白是2000年才鑒定出來的一種新蛋白，對其功能結構還缺乏徹底了解。目前僅對人、小鼠ACE2蛋白有深入研究，對家貓ACE2的研究仍屬空白。 本研究克隆并表達了家貓ACE2基因，并對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、功能結構進行分析和預測。通過RT-PCR方法檢測了ACE2在各主要組織器官中的表達情況，并對部分基因進行了表達研究，具體研究內(nèi)容如下： 根

4、據(jù)已經(jīng)報道的人及小鼠的ACE2基因mRNA序列設計引物，從家貓肺臟總RNA中分段擴增出家貓ACE2基因mRNA編碼區(qū)序列。序列分析結果表明，家貓ACE2基因mRNA編碼區(qū)序列長2418bp，所編碼的蛋白含805個氨基酸殘基。經(jīng)序列比較發(fā)現(xiàn)，家貓ACE2基因mRNA編碼區(qū)序列與人、小鼠及大鼠ACE2基因mRNA編碼區(qū)序列的同源性分別為86％、84％和84％，氨基酸同源性分別為85％、81％和81％。 利用生物信息學方法對家貓ACE

5、2蛋白的物理化學性質(zhì)、信號肽、跨膜螺旋、蛋白質(zhì)二級結構、蛋白質(zhì)結構域、基序以及蛋白質(zhì)家族進行預測，同時綜合各工具的預測結果對家貓ACE2蛋白的各方面性質(zhì)進行了分析。與其它幾種動物的ACE2相比，貓ACE2的SARS-CoV結合功能區(qū)氨基酸與人的同源性最高，提示貓可能在SARS-CoV的傳播中起重要作用。 通過RT-PCR方法，檢測家貓各組織器官中ACE2蛋白的表達分布，證實家貓主要組織器官中ACE2的表達分布與已經(jīng)報道的人體分布

6、情況一致。 通過對信號肽、跨膜螺旋的預測，再設計了一對引物特異性擴增信號肽與跨膜螺旋之間的片段。進一步構建原核表達質(zhì)粒pET-ACE2，在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中實現(xiàn)了表達，融合蛋白分子量約為85kD。 通過WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)，家貓ACE2蛋白原核表達產(chǎn)物能夠與羊抗人ACE2蛋白多克隆抗體交叉反應。 綜上所述，本論文克隆鑒定了貓ACE2基因編碼區(qū)序列，證明貓ACE2與人ACE2具有相似的