18677.β19β20loop定點突變對蘇云金芽胞桿菌crylac蛋白結構和功能的影響

1、學校代碼10542密級學號2鯉旦刁41106813191320loop定點突變對蘇云金芽胞桿菌CrylAc蛋白結構和功能的影響EffectsofSiteDirectedMutagenesisof』319』320LoopofCrylAcfromB臼cill彩sthuringiensisontheStructureandFunction研究生姓名指導教師姓名、職稱易思明學科專業(yè)微生物學’———?！狶研究

2、方向——基因工程湖南師范大學學位評定委員會辦公室二零一二年五月摘要蘇云金芽胞桿菌(BacillusThuringiensis，簡稱Bt)晶體毒素被廣泛用作農業(yè)害蟲殺蟲劑。這些晶體蛋白被昆蟲吞食后經過一系列復雜機制，在昆蟲中腸通過與不同受體的順序作用而形成孔洞，破壞了昆蟲體內滲透壓，導致昆蟲裂解死亡。本研究采用寡核苷酸誘導的環(huán)形定點突變技術，將蘇云金芽胞桿菌晶體蛋白CrylAc結構域III上B19B20loop上的13個氨基酸分別用丙氨酸

3、替換，構建了13個單點突變子。將它們和野生型菌株及無晶體突變株cry—B用GTris培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后用顯微鏡觀察晶體形成情況，同時用SDSPAGE檢測蛋白表達量。結果除了T557A、L564A、D568A、F569A和cryB外，其余菌株都能形成典型的菱形晶體；除了T557A、L564A、F569A和cryB以外，其余菌株都出現(xiàn)了130KDa蛋白帶。奇怪的是，盡管D568A不能形成菱形晶體，但是卻有130KOa目標蛋白帶出現(xiàn)。將突變毒

4、素蛋白和野生型毒素蛋白分別飼喂棉鈴蟲(Helicoverpaarmigel。臼)和甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)初孵幼蟲，結果卻呈現(xiàn)很大差異。對棉鈴蟲的生測結果顯示，T559A毒力提高186倍，P555A、$560A、L561A毒力分別提高了12％、31％和64％。而T557A、L564A、F569A喪失了毒力的80％以上，其余突變子相對野生型菌株毒力均有不同程度降低但是仍能明顯抑制棉鈴蟲的生長。對甜菜夜蛾生測結果顯示，T