甘藍(lán)型油菜與向日葵高γ-亞麻酸基因工程研究.pdf

1、γ-亞麻酸(GLA;C18:3-Δ<'6,9,12>)是一種對人體具有重要營養(yǎng)、保健和醫(yī)療功能的多不飽和脂肪酸,由于其生物資源匱乏,導(dǎo)致人們在日常膳食中缺乏GLA.因此,利用轉(zhuǎn)基因油料作物大規(guī)模的生產(chǎn)GLA成為學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn).該課題從卷枝毛霉中克隆Δ<'6>-脂肪酸脫氫酶基因,與種子特異性啟動子連接,農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化油菜與向日葵,旨在通過基因工程技術(shù)提高傳統(tǒng)油料作物(油菜和向日葵)的γ-亞麻酸含量來滿足功能食品和生化制藥的需求.⑴克隆和

2、鑒定Δ<'6>-脂肪酸脫氫酶基因:通過RT-PCR方法從絲狀真菌卷枝毛霉中克隆Δ<'6>-脂肪酸脫氫酶基因,PCR產(chǎn)物亞克隆到酵母表達(dá)載體pYES2.0上,在大腸桿菌中篩選到含有目的基因的重組質(zhì)粒pYES412,用醋酸鋰方法轉(zhuǎn)化到營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株INVScl中,在SC-Ura 合成培養(yǎng)基因篩選酵母轉(zhuǎn)化子,在合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下,加入外源底物亞油酸,經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)后,收集菌體,通過氣相色譜對轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行脂肪酸成分分析,結(jié)果表明:γ

3、-亞麻酸占總脂肪的50.07﹪.因此,該工程菌株在工業(yè)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-亞麻酸方面具有很大的應(yīng)用前景.⑵克隆和鑒定向日葵種子特異性啟動子:通過PCR方法從向日葵基因組中克隆種子貯藏蛋白Ha ds10 G1基因起始密碼子前200bp、500bp和1300bp 的序列,構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301上驅(qū)動GUS基因的表達(dá),農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草NC89,通過對轉(zhuǎn)基因煙草不同組織進(jìn)行GUS染色證明1300bp序列具有啟動外源基因和種

4、子中特異表達(dá)的功能.⑶構(gòu)建攜帶Δ<'6>-脂肪酸脫氫酶基因的種子特異性和組成型植物表達(dá)載體;將Δ<'6>-脂肪酸脫氫酶基因分別構(gòu)建在35S啟動子和種子特異性啟動子驅(qū)動的植物表達(dá)載體上,表達(dá)載體的特點(diǎn)是目的基因和GUS基因在兩個獨(dú)立的表達(dá)盒上,有利于通過GUS染色對再生植株進(jìn)行初步鑒定.⑷轉(zhuǎn)Δ<'6>-脂肪酸脫氫酶基因甘藍(lán)型油菜的獲得:采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Δ<'6>-脂肪酸脫氫酶基因?qū)敫仕{(lán)型油菜中雙6號,PCR和Southern雜交分析表

5、明,獲得10株攜帶Δ<'6>-脂肪酸脫氫酶基因的陽性植株.⑸向日葵遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)Δ<'6>-脂肪酸脫氫酶基因的獲得;以向日葵的莖尖為外植體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,以抗性培養(yǎng)7天的外植體GUS基因純合表達(dá)的為指標(biāo)測定轉(zhuǎn)化率.結(jié)果表明:潮霉素適宜的篩選濃度為10mg/L,農(nóng)桿菌侵染濃度OD<,600>=0.8,果膠酶(0.05﹪)與纖維素酶(0.1﹪)共同消化外植體30min,共培養(yǎng)溫度24℃,共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮100μmol