23079.應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)rna干擾(rnai)技術(shù)研究雌鼠下丘腦nell2基因表達(dá)與gnrh基因表達(dá)的關(guān)系

1、上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文1第一部分第一部分大鼠大鼠NELL2基因基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定前言RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一項(xiàng)新興的基因沉默技術(shù)，主要通過小干擾RNA（smallinterfereneeRNA，siRNA）和micrNA（miRNA）兩種小RNA分子來發(fā)揮作用。miRNA是一種大小約21～25bp的非編碼單鏈RNA，它的5′端有一磷酸基團(tuán)，3′端為羥基，來自具有莖

2、環(huán)結(jié)構(gòu)的前體（premiRNA）[1]。miRNA能夠有效的抑制目的基因的表達(dá)[2]，主要通過以下2種途徑：（1）不完全匹配，翻譯被抑制而不影響mRNA的穩(wěn)定性；（2）完全匹配，mRNA被切割進(jìn)而下調(diào)基因表達(dá)。此外miRNA還可以通過指導(dǎo)其靶向基因的mRNA快速脫腺苷化，進(jìn)而導(dǎo)致mRNA的快速衰減和表達(dá)水平的降低[3]。慢病毒載體是一種復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，具有可感染非分裂細(xì)胞和分裂期細(xì)胞，目的基因整合至靶基因組可以長期穩(wěn)定表達(dá)、免

3、疫反應(yīng)小等特點(diǎn)，是一種比較理想的用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因研究的理想載體。慢病毒載體介RNAi就是將慢病毒載體高效感染和整合的特性與RNAi特異性抑制同源基因表達(dá)的作用相結(jié)合，充分發(fā)揮其高效、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，同時(shí)利用它能在各類哺乳動(dòng)物細(xì)胞、多種疾病的離體細(xì)胞以及不同動(dòng)物在體細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的RNAi[47]抑制作用。自Stewart等[8]于2003年首次報(bào)道使用該技術(shù)后，該技術(shù)即被廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)病機(jī)理的研究。在本部分實(shí)驗(yàn)我們利用分子生

4、物學(xué)技術(shù)完成大鼠NELL2micrNA慢病毒載體的構(gòu)建以及病毒包裝，并擬在體外驗(yàn)證病毒能夠有效感染細(xì)胞，為下一部分大鼠體內(nèi)應(yīng)用RNAi技術(shù)研究NELL2基因?qū)nRH基因表達(dá)及血清性激素水平的影響奠定基礎(chǔ)。上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文3MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑Promega，USAbactoyeastextractOxoid，Englbacto–tryptonOxoid，Engl瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Biomiga，USA高純

5、度質(zhì)粒小提中量試劑盒天根生物公司T4polymeraseTakaRa，JapanPstI等限制性內(nèi)切酶TakaRa，JapanNotI等限制性內(nèi)切酶NEB，AmericaCIPTakaRa，Japan1.1.3實(shí)驗(yàn)菌株、質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)菌株、質(zhì)粒大腸桿菌DH5α受體菌上海市兒童醫(yī)院遺傳所惠送pcDNA3.1()neoVectInvitrogenUSApGEMT載體TakaRa，Japan1.1.4主要試劑配制主要試劑配制溶液I（質(zhì)粒提取）1M葡

6、萄糖2.5ml1MTris.Cl（pH8.0）0.5MEDTA（pH8.0)）1ml加H2O定容至50ml，高壓滅菌存4℃溶液II（質(zhì)粒提?。?0MNaOH1ml10%SDS5ml，加H2O定容至50ml混勻，室溫存放溶液III（質(zhì)粒提?。?4.73g乙酸鉀，5.75ml冰乙酸加H2O定容至50ml，4℃存放1.2實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法1.2.1實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程（1）將NELL2基因分三段分別擴(kuò)增，相應(yīng)的PCR產(chǎn)物（pNELL2I、pNELL