應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)研究Skp2基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞周期、凋亡和增殖的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)特異性RNA干擾慢病毒表達(dá)載體，抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞中Skp2基因的表達(dá)。研究Skp2基因沉默后P27、CyclinD1、Caspase-3表達(dá)的變化，以及對(duì)HEC-1-A細(xì)胞周期、凋亡和增殖的影響。 方法：構(gòu)建U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)、帶有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)志的、表達(dá)針對(duì)Skp2基因的慢病毒LV-shRNA載體，轉(zhuǎn)染HEC-1-A細(xì)胞，同時(shí)以轉(zhuǎn)染陰性載體的HEC-1-A細(xì)胞作為對(duì)

2、照。熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)以確定轉(zhuǎn)染效率，采用RT-PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR在mRNA水平檢測(cè)Skp2基因表達(dá)的變化，采用Western blotting在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)Skp2基因表達(dá)的變化，以明確RNAi的抑制效率。并運(yùn)用同樣的方法分別從mRNA和/或蛋白質(zhì)水平檢測(cè)P27、CyclinD1、Caspase-3表達(dá)的變化，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、CCK-8法、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Skp2 RNA干擾后細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的變化，分析Skp2

3、基因沉默對(duì)P27、CyclinD1、Caspase-3表達(dá)水平以及細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果：1.成功構(gòu)建了四對(duì)針對(duì)Skp2基因不同位點(diǎn)的RNAi慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定干擾片斷的堿基序列及插入位點(diǎn)完全正確；2.在293T細(xì)胞中包裝慢病毒，獲得高滴度慢病毒上清；3.利用重組慢病毒載體將Skp2 shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到70％以上；4.構(gòu)建的重組慢病毒LV-Skp2-1

4、、LV-Skp2-2、LV-Skp2-3、LV-Skp2-4無(wú)論在mRNA水平還是在蛋白質(zhì)水平均能抑制Skp2基因的表達(dá)，其中LV-Skp2-3、LV-Skp2-4的基因沉默效果較好，抑制率可以達(dá)到50％以上；5.利用RNAi技術(shù)沉默Skp2基因表達(dá)，對(duì)p27、cyclinD1的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有影響，卻可以在蛋白質(zhì)水平上調(diào)P27的表達(dá)，并下調(diào)CyclinD1的表達(dá)；6.抑制Skp2基因表達(dá)影響HEC-1-A細(xì)胞周期的進(jìn)程，使其發(fā)生G

5、2/M期阻滯；7.下調(diào)Skp2基因表達(dá)抑制了HEC-1-A細(xì)胞增殖，使其生長(zhǎng)速度減緩。8.抑制Skp2基因表達(dá)對(duì)HEC-1-A細(xì)胞凋亡沒(méi)有顯著影響。 結(jié)論：利用RNA干擾技術(shù)，可有效下調(diào)Skp2基因的表達(dá)，引起P27蛋白表達(dá)的上調(diào)和CyclinD1蛋白表達(dá)的下調(diào)，但對(duì)p27、cyclinD1的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有影響。Skp2基因的沉默影響HEC-1-A的細(xì)胞周期，發(fā)生G2/M期阻滯，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢，