24180.甘藍(lán)染色體圖譜的構(gòu)建及si基因的定位研究

1、西南大學(xué)博士學(xué)位論文甘藍(lán)染色體圖譜的構(gòu)建及SI基因的定位研究姓名：王永申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：朱利泉20100501兩南人學(xué)博十學(xué)1=奇：論文C伸展DNA纖維的制備：采用勻漿法獲得分布均勻、雜質(zhì)較少、密度適中的細(xì)胞核；采J分子梳理法制備山伸展度良好、密度合適以及平行的DNA纖維。2FISH體系的建立：通過熒光原位雜交相關(guān)參數(shù)的探索，建立了適合不同伸長度的靶DNA載體FISH體系。對中期和粗線期染色體制片采用

2、相同的處理步驟，而DNA纖維制片無需進(jìn)行蛋白酶處理和預(yù)變性。A片子的預(yù)處理：100l上g／mL的RNaseA379C處理1h可以增強(qiáng)雜交的信噪比；500ug／mL胃蛋白酶在37℃處理40min可以有效的去除蛋白質(zhì)；70％去離子甲酰胺中70℃變性2min可獲得較好的雜交效果。B雜交混合液組成：去離子甲酰胺50％；硫酸葡聚糖75％：2SSC15ng／／L探針；05％SDS；05／zg／／zL鮭魚精DNA。C洗脫條件：重復(fù)拷貝基因，洗脫溫度4

3、2℃，洗脫時(shí)間8min；低拷貝或單拷貝基因，洗脫溫度37℃，洗脫時(shí)間5mira如果靶DNA為DNA纖維時(shí)，洗脫溫度40℃，洗脫時(shí)間5min。3甘藍(lán)根尖中期染色體的核型分析：甘藍(lán)體細(xì)胞染色體數(shù)2n=18，其核型公式為K(2n)=lS=12m6sm，其中1、2、4、5、6和8號染色體為中部著絲粒染色體，3、7和9號染色體為近中部著絲粒染色體：7號染色體的短臂末端具有隨體；甘藍(lán)的核型屬丁2A型，即對稱型核型。4高分辨率5SrDNAFISH研究

4、：以羽衣甘藍(lán)為實(shí)驗(yàn)材料，采用熒光原位雜交技術(shù)將DIG標(biāo)記的5SrDNA探針定位丁不同分辨率的絨氈層細(xì)胞中期染色體、粗線期染色體以及伸長DNA纖維上，目的是明確羽農(nóng)甘藍(lán)5SrDNA在染色體的分布和具體拷貝數(shù)情況，為進(jìn)一步利用FISH進(jìn)行基因定位和細(xì)胞遺傳圖譜構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。在中期染色體和粗線期染色體上，都同時(shí)獲得3個(gè)雜交信號位點(diǎn)(a、b、c)，且位于2號染色體的長臂近著絲粒區(qū)域，其信號強(qiáng)度為bac；而在伸KDNA纖維上，出現(xiàn)了3種不同長度的

5、念珠狀長鏈(a、b、c)，其物理人小分別為257kb、359kb和134kb，粗略估算出3個(gè)5SrDNA位點(diǎn)的拷貝數(shù)分別為510、712和266。5甘藍(lán)2號染色體細(xì)胞遺傳圖普的構(gòu)建：以甘監(jiān)第4連鎖群上的3個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)(p0147、pR94和pNl20)和5SrDNA為探針，并分別用生物素和地高辛標(biāo)記，然后與甘藍(lán)絨氈層細(xì)胞中期染色體和粗線期染色體進(jìn)行雙色熒光原位雜交，構(gòu)建甘藍(lán)2號染色體細(xì)胞遺傳圖譜，明確分子標(biāo)記在染色體上的真實(shí)距離。A標(biāo)記探