24180.甘藍染色體圖譜的構建及si基因的定位研究

1、西南大學博士學位論文甘藍染色體圖譜的構建及SI基因的定位研究姓名：王永申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：朱利泉20100501兩南人學博十學1=奇：論文C伸展DNA纖維的制備：采用勻漿法獲得分布均勻、雜質較少、密度適中的細胞核；采J分子梳理法制備山伸展度良好、密度合適以及平行的DNA纖維。2FISH體系的建立：通過熒光原位雜交相關參數(shù)的探索，建立了適合不同伸長度的靶DNA載體FISH體系。對中期和粗線期染色體制片采用

2、相同的處理步驟，而DNA纖維制片無需進行蛋白酶處理和預變性。A片子的預處理：100l上g／mL的RNaseA379C處理1h可以增強雜交的信噪比；500ug／mL胃蛋白酶在37℃處理40min可以有效的去除蛋白質；70％去離子甲酰胺中70℃變性2min可獲得較好的雜交效果。B雜交混合液組成：去離子甲酰胺50％；硫酸葡聚糖75％：2SSC15ng／／L探針；05％SDS；05／zg／／zL鮭魚精DNA。C洗脫條件：重復拷貝基因，洗脫溫度4

3、2℃，洗脫時間8min；低拷貝或單拷貝基因，洗脫溫度37℃，洗脫時間5mira如果靶DNA為DNA纖維時，洗脫溫度40℃，洗脫時間5min。3甘藍根尖中期染色體的核型分析：甘藍體細胞染色體數(shù)2n=18，其核型公式為K(2n)=lS=12m6sm，其中1、2、4、5、6和8號染色體為中部著絲粒染色體，3、7和9號染色體為近中部著絲粒染色體：7號染色體的短臂末端具有隨體；甘藍的核型屬丁2A型，即對稱型核型。4高分辨率5SrDNAFISH研究

4、：以羽衣甘藍為實驗材料，采用熒光原位雜交技術將DIG標記的5SrDNA探針定位丁不同分辨率的絨氈層細胞中期染色體、粗線期染色體以及伸長DNA纖維上，目的是明確羽農甘藍5SrDNA在染色體的分布和具體拷貝數(shù)情況，為進一步利用FISH進行基因定位和細胞遺傳圖譜構建奠定基礎。在中期染色體和粗線期染色體上，都同時獲得3個雜交信號位點(a、b、c)，且位于2號染色體的長臂近著絲粒區(qū)域，其信號強度為bac；而在伸KDNA纖維上，出現(xiàn)了3種不同長度的

5、念珠狀長鏈(a、b、c)，其物理人小分別為257kb、359kb和134kb，粗略估算出3個5SrDNA位點的拷貝數(shù)分別為510、712和266。5甘藍2號染色體細胞遺傳圖普的構建：以甘監(jiān)第4連鎖群上的3個標記位點(p0147、pR94和pNl20)和5SrDNA為探針，并分別用生物素和地高辛標記，然后與甘藍絨氈層細胞中期染色體和粗線期染色體進行雙色熒光原位雜交，構建甘藍2號染色體細胞遺傳圖譜，明確分子標記在染色體上的真實距離。A標記探