抑制葉片衰老的ipt基因在小麥中的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、小麥植株的衰老與籽粒形成、灌漿、成熟的生長發(fā)育進(jìn)程同步進(jìn)行,是限制籽粒發(fā)揮增產(chǎn)潛力的內(nèi)在因素.若此時(shí)能夠有效延緩小麥衰老,便可顯著提高小麥的籽粒產(chǎn)量.利用噴施外源激素及其它化學(xué)制劑可改善葉片的早衰,但這往往受生產(chǎn)成本和環(huán)境因素的制約.利用基因工程向小麥中導(dǎo)入抑制衰老的SAG<,12>-ipt自動(dòng)調(diào)控元件便可避免這一缺點(diǎn).該自動(dòng)調(diào)節(jié)元件由衰老誘導(dǎo)的SAG<,12>啟動(dòng)子控制,由此導(dǎo)致細(xì)胞分裂素的暫時(shí)過量表達(dá),從而延緩葉片衰老.付永彩等人將

2、該元件轉(zhuǎn)入水稻,獲得了葉片衰老明顯受到抑制的轉(zhuǎn)基因植株.該研究試圖在小麥中轉(zhuǎn)入SAG<,12>-ipt自動(dòng)調(diào)控元件以期獲得抑制葉片衰老的轉(zhuǎn)基因小麥新材料.自1992年第一株轉(zhuǎn)基因小麥問世以來,小麥的遺傳轉(zhuǎn)化研究已取得了長足進(jìn)展,其中90﹪以上的轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)峭ㄟ^基因槍法獲得的.關(guān)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥的研究報(bào)道較少.因此本文通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該自動(dòng)調(diào)控元件和具除草劑（Basta）抗性的bar基因轉(zhuǎn)入小麥,得到了表型變化的轉(zhuǎn)化植株,初步判斷

3、為轉(zhuǎn)ipt基因小麥,主要結(jié)果如下：1 小麥幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)及分化研究 供試的五個(gè)小麥品種,采用盾片朝上的接種方式誘導(dǎo)的愈傷組織分化頻率均相對(duì)較高;0.5mg/L ABA的誘導(dǎo)處理可明顯提高愈傷組織分化頻率.其中Bobwhite和95319獲得較高的再生體系;誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2,4-D 2mg/L+LH 500mg/L+ABA 0.5mg/L+蔗糖3﹪+瓊脂粉0.7﹪,pH 5.8;分化培養(yǎng)基：MS+LH 500mg/L+NAA 0

4、.5mg/L+KT 0.5mg/L+蔗糖3﹪+瓊脂粉0.7﹪,pH 5.8;生根培養(yǎng)基：1/2MS+IBA5mg/L+蔗糖 3﹪+瓊脂粉0.7﹪,pH5.8.2 受體材料對(duì)篩選劑的敏感性測驗(yàn) 將愈傷組織分別接種到含有不同濃度Km、G418和Basta的篩選培養(yǎng)基中,測驗(yàn)其對(duì)愈傷組織抑制效果.結(jié)果表明,Km、G418和Basta對(duì)愈傷組織的選擇壓分別為50mg/L、20mg/L和5mg/L.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化條件的研究 感染時(shí)

5、間、AS、Silwet和輔助處理對(duì)轉(zhuǎn)化的影響實(shí)驗(yàn)表明：重懸農(nóng)桿菌用的MS液體培養(yǎng)基中加入100umol/L的AS和0.05﹪的Silwet,得到抗性愈傷組織的頻率較高;采用真空負(fù)壓或空彈轟擊輔助農(nóng)桿菌感染30min,得到抗性愈傷組織的頻率也較高.另一途徑：不經(jīng)頭孢霉素抑制農(nóng)桿菌菌生長及Basta篩選的愈傷組織,直接在分化培養(yǎng)基上與農(nóng)桿菌共培養(yǎng),獲得了表型變化的轉(zhuǎn)化植株.4 轉(zhuǎn)化植株的獲得及PCR檢測 感染后的幼胚愈傷組織經(jīng)過5mg/L

6、的Basta的選擇.其中,品種Bobwhite得到了5個(gè)抗性植株,經(jīng)PCR檢測,有3個(gè)植株的Bar基因呈陽性;品種95319得到了3個(gè)抗性株,經(jīng)PCR檢測,有2個(gè)植株的Bar基因呈陽性.未經(jīng)Basta選擇的轉(zhuǎn)化愈傷組織得到Bobwhite再生植株31個(gè).有7個(gè)植株的表型發(fā)生了變化,經(jīng)PCR檢測,有兩株呈陽性.5 轉(zhuǎn)基因小麥的表型觀察 本研究得到的轉(zhuǎn)基因植株表型變化有三類.一是多小花：對(duì)照植株每個(gè)小穗上只開三朵小花,而經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的植株